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中华田园犬耳缘成纤维细胞系的建立与生物学特性的研究

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目录

声明

摘要

前言

1 我国资源犬种现状

1.1 本国犬种资源保护与利用现状

1.2 中华田园犬概况

2 犬体细胞的相关研究进展

2.1 犬的体细胞核移植

2.2 转基因克隆技术

3 犬种资源保存技术

3.1 活种保存

3.2 冷冻保存

3.3 基因保存技术

4 动物细胞与细胞库

4.1 动物细胞培养技术的发展

4.2 动物细胞培养技术的应用

4.3 细胞体外培养过程及方法

4.4 细胞体外培养冷冻

4.5 细胞系的构建与鉴定

5 细胞生物学特性的研究

5.1 细胞形态学观察

5.2 细胞活力检测

5.3 细胞生长曲线的测定

5.4 微生物污染a"JN定

5.5 染色体标本的制备及核型分析

6 本试验的目的及意义

1.1 试验动物

1.2 主要试剂

1.3 试验器材

2 方法

2.1 原代培养

2.2 传代培养

2.3 细胞纯化

2.4 细胞冻存

2.5 细胞复苏

3 生物特性研究

3.1 细胞存活率测定

3.2 细胞生长动力学观察

3.3 细胞微生物污染检测

3.4 染色体的制备及核型分析

结果

1 细胞生长特性

1.1 原代细胞生长状态及形态特征

1.2 细胞纯化

1.3 传代培养生长状态及形态特征

1.4 细胞复苏后生长状态及形态特征

2 生物学特性研究

2.1 细胞存活率的测定

2.2 细胞生长动力学观察

2.3 细胞微生物污染检测

4.4 染色体的制备及核型分析

讨论

1 成纤维细胞体外培养中的问题

1.1 原代培养

1.2 胰蛋白酶消化

1.3 培养基成分

1.4 细胞保存

2 生物学特性研究过程中的问题

2.1 生长动力学观察

2.2 微生物污染

2.3 染色体标本制备

3 犬成纤维细胞系构建的意义

结论

参考文献

致谢

作者简介

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摘要

目的及意义:为了在细胞水平上将中华田园犬的遗传资源永久保存下来,并使保存下来的细胞能够在犬超数排卵技术的基础上为下一步核移植做准备,本试验选取了八个月健康的北方中华田园犬作为研究对象,采用组织块培养法构建了犬耳缘组织的成纤维细胞系。根据ATCC的具体要求,经原代培养、传代培养以及生物学特性的检测建立健康可利用的细胞系。
  结果:本试验培养的细胞在培养的各个阶段均呈现典型的成纤维细胞形态特征。原代培养因天数、密度不同出现个体差异,生长趋势呈现放射状或者漩涡状。对于所构建的细胞系,分别冻存了原代,二代,四代及六代。
  利用台盼蓝染色法检测细胞存活率,复苏后比冻存前有降低趋势,但均在95%以上。使用计数板计数F2、F4、F6代细胞一周的数目变化,绘制了复苏后细胞的生长曲线,均呈现“S”型,与细胞生长的一般规律相符。在含有15%胎牛血清的DMEM内连续6次传代,细胞形态特征及生长情况没有显著差异。
  培养过程中,进行了微生物污染检测;眼观、镜检以及利用无抗生素的培养液中培养的方式检测细菌、真菌、及病毒。使用Hoechst33258染色法检测支原体。结果均为阴性,表明培养物没有被污染。
  染色体核型分析:体外培养的中华田园犬耳部成纤维细胞正常染色体数是2n=78,包括38组常染色体,1组性染色体。在测定的中期细胞中,均以二倍体为主,占镜检细胞总数90%以上,表明所建立的细胞系遗传性状基本稳定。
  结论:构建的中华田园犬耳部成纤维细胞系符合ATCC细胞系构建要求。

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