• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >多功能PLGA微粒式人工抗原提呈细胞对肿瘤的主动免疫治疗
【6h】

多功能PLGA微粒式人工抗原提呈细胞对肿瘤的主动免疫治疗

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

第一个书签之前

展开▼

摘要

人工抗原提呈细胞(Artificial antigen-presenting cells,aAPCs)在T细胞扩增及肿瘤免疫治疗中发挥重要作用.按照载体类型不同,aAPCs可分二类:一类是细胞性载体的aAPCs,即通过多基因转染载体细胞,如3T3,K562和果蝇细胞等,使其表达相应的peptide/MHC复合体(pMHC)分子和共刺激分子;第二类是非细胞性载体的aAPCs.常用载体有磁珠,聚苯乙烯胶乳微球,外泌体和脂质体等,人工制备的pMHC分子和共刺激分子等被共价偶联在载体表面.本室和其他研究者的诸多体内观察性研究已证实,静态表面载体的非细胞型aAPCs具有较强的靶向活化和扩增抗原特异性T细胞的能力,在对肿瘤等疾病的主动免疫治疗方面具有潜在应用价值.但是,以往的aAPCs设计只是在表面携带2或3种免疫分子;研究尚未涉及体内作用机制和运行规律;而且所用载体多为磁珠、聚苯乙烯胶乳微球等材料,不能在体内生物降解,不适于临床应用.为此,本课题在前期基础上拟进一步探讨aAPCs的体内作用机制,并全面改造和优化aAPCs系统.(1)选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微粒做载体,可在体内生物降解,组织相容性高,无毒性,以适应人体使用.(2)在微粒内部混合包裹IL-2、IL-15、CCL21以及CTLA-4和PD-1的封闭性抗体,通过旁分泌方式刺激多信号通路,以趋化募集和活化T细胞,并封闭抑制性信号通路.(3)在微粒表面联合吸附两种pMHC多聚体、CD28和4-1BB单抗、CD2单抗以及CD47分子,为T细胞活化提供多抗原信号、共刺激信号和粘附分子,同时为微粒提供抗吞噬分子.我们将研制该多抗原表位、高仿生、适用于人体的多功能PLGA微粒式人工抗原提呈细胞(MaAPCs),探讨其对黑色素皮下瘤模型鼠的疗效和体内的作用机制、时空分布以及与免疫细胞的接触规律、对整体免疫功能的影响和可能引起的毒副作用等,以期为肿瘤疾病提供一种新的、高能的抗原特异性主动免疫疗法. 研究目的: 研究装载11种免疫分子的MaAPCs在体内外扩增肿瘤抗原特异性T细胞及抑制肿瘤生长的能力,并探讨其体内作用机制. 研究方法及结果: 1、内部包裹蛋白分子的表面功能化PLGA微粒(PLGA-MPs)的制备、表征及功能检测:以PLGA为原料,采用复乳溶剂挥发法制备内部包裹BSA、平均粒径约为4.6μm的PLGA-MPs,EDC/NHS化学修饰法使其表面获得-NH2+而功能化,使PLGA-MPs获得偶联蛋白的能力.利用扫描电镜、粒径分析仪和Zeta电位分析仪对PLGA-MPs进行表征,并通过蛋白定量和流式细胞术分析PLGA-MPs包裹和偶联蛋白的能力. 2、MaAPCs的制备及验证:制备内部包裹IL-2、IL-15、CCL21以及CTLA-4和PD-1的封闭性抗体的功能化PLGA-MPs,并将其与两种pMHC多聚体(H-2Kb/TRP2-Ig、H-2Db/gp100-Ig)、CD28和4-1BB单抗、CD2单抗以及CD47-Fc等六种免疫分子共同孵育,使其联合吸附于微粒表面,制备装载11种免疫分子的MaAPCs.ELISA实验结果显示:MaAPCs内部包裹的五种免疫分子均可缓慢释放,且互不干扰;颗粒表面有效偶联了六种免疫分子,且不明显影响内部包裹蛋白的缓慢释放效率.说明本室自制的MaAPCs具有正确、完整表型和第三信号分子的旁分泌缓释功能. 3、MaAPCs体外扩增抗原特异性CTL细胞的功能研究:在体外,MaAPCs与小鼠脾脏淋巴细胞共培养7天,同时设置空白PLGA微粒(Blank-MPs)、表面负载六种分子的PLGA微粒(MP6+)和只有内部包裹五种分子的PLGA微粒(MP5+)的共培养对照,然后行H-2Kb/TRP2-Ig或H-2Db/gp100-Ig二聚体荧光染色,流式分析共培养后小鼠脾脏淋巴细胞中TRP2180–188和gp10025-33特异性CD8+T细胞的频率.与Blank-MPs组频率相比(0.19%),MaAPCs、MPs6+和MPs5+各组在没有添加IL-2的条件下,TRP2180–188特异性CD8+T细胞的扩增倍数分别为268.4倍(MaAPCs组:51.0%)、124.2倍(MP6+组:23.6%)和15.5倍(MP5+组:2.95%);gp10025-33特异性CD8+T细胞扩增倍数分别为Blank-MPs组(0.13%)的333.1倍(MaAPCs组:43.3%)、166.9倍(MP6+组:21.7%)和16.6倍(MP5+组:2.16%). 4、MaAPCs体内扩增特异性CTL并抑制肿瘤生长的功能研究:制备Blank-MPs及负载不同免疫分子的PLGA微粒:MP2+(Blank-MPs+H-2Kb/TRP2-Ig和H-2Db/gp100-Ig)、MP5+(MP2++anti-CD2/anti-4-1BB/anti-CD28)、MP6+(MP5++CD47)、MP6++2(MP6++IL-2/IL-15)、MP6+3+(MP6++2+CCL21)及MaAPCs(MP6+3++anti-CTLA-4/anti-PD-1),分别于B6鼠接种B16细胞后第7、9和11天经尾静脉三次注射,对黑色素皮下瘤模型鼠进行主动免疫治疗,每三天观察肿瘤生长情况,第28天处死小鼠,二聚体染色,流式检测外周血、脾脏和肿瘤组织标本中TRP2180–188和gp10025-33特异性CD8+T细胞的频率.结果显示,负载11种免疫分子的MaAPCs明显比其它各aAPCs更能有效地促进治疗鼠体内TRP2180–188和gp10025-33特异性CD8+T细胞的扩增、提高肿瘤组织局部两种肿瘤抗原表位特异性CD8+T细胞的浸润程度,并有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期. 5、MaAPCs体内抗肿瘤的机制研究:将Blank-MPs、MP2+、MP5+、MP6+、MP6++2、MP6+3+及MaAPCs分别同上于第7、9和11天经尾静脉注射治疗黑色素瘤皮下模型鼠,第14天杀鼠取脾细胞和肿瘤组织,检测各组aAPCs诱导机体抗肿瘤免疫反应的能力,分析MaAPCs的体内抗肿瘤机制.结果显示,MaAPCs比其他各组更能有效促进机体内肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的扩增;提高抗原特异性CTL中活化和记忆性细胞的比例;增强CD8+T细胞、TRP2180–188和gp10025-33特异性CTL的脱颗粒能力及对肿瘤细胞的特异性杀伤能力;同时,MaAPCs比其他各组更能有效地抑制调节性T细胞的增殖和CD8+T细胞及TRP2180–188和gp10025-33特异性CTL的凋亡;提高CD8+T及TRP2180–188、gp10025-33特异性CTL的体外增殖活性;促进炎症性细胞因子分泌,并降低抑制性细胞因子的产生.结果显示MaAPCs是通过以上多种机制增强机体抗肿瘤的特异性免疫应答能力,从而达到抑制肿瘤生长、延长生存期的目的. 6、MaAPCs体内运行分布及与免疫细胞的接触规律研究:制备吲哚青绿(ICG)标记的MaAPCs、H-2Kb-aAPCs、CD47-aAPCs和Blank-MPs,于造模后第11天分别经尾静脉注入肿瘤模型鼠体内,在不同时间点进行小鼠活体荧光成像和器官离体成像.制备PE标记的MaAPCs,于造模后第11天经尾静脉注入肿瘤模型鼠体内,4小时后取脾脏制备冰冻切片,分别用FITC标记的CD4、CD8、CD11b、F4/80和CD19单抗染色,而后共聚焦显微镜下拍照观察MaAPCs与各类免疫细胞的共定位情况.结果显示,MaAPCs经静脉输注后很快分布于全身各器官组织;与H-2Kb-aAPCs(无靶向抗原)、CD47-aAPCs(无抗吞噬分子)和Blank-MPs相比,更多的MaAPCs分布在脾脏和淋巴结等免疫器官;而且可以在体内滞留达36h以上.在脾脏组织切片中,MaAPCs可靶向性地与CD8+T细胞直接结合,促进抗原特异性CTL细胞的活化和扩增,而较少被巨噬细胞和DC细胞吞噬. 7、MaAPCs治疗对机体整体免疫功能的影响和毒副作用的初步研究:造模后第7、9、11天,对载瘤鼠分别进行MaAPCs、Blank-MPs或PBS的尾静脉三次输注治疗,第14天分析脾脏淋巴细胞群各种免疫细胞的数量或功能,第14、21、和28天检测血常规和肝肾功能,并对主要脏器进行病理分析.结果显示,MaAPCs治疗可提高载瘤鼠脾脏CD3+T和CD8+T细胞比例和血液中的白细胞数、淋巴细胞数和淋巴细胞比例等多项指标,但对其他免疫细胞未产生明显影响;可一定程度增强载瘤鼠脾脏T细胞的同种增殖能力以及对其他肿瘤细胞(S180和SP2/0)的非特异性杀伤效应;但对NK的数量和杀瘤活性没有明显影响,对血清中肿瘤细胞特异性IgG抗体的水平也无显著影响;对血常规指标、肝肾功能和主要脏器未造成明显病理损伤. 研究结论:成功制备了可生物降解的、装载11种免疫分子的多功能人工抗原提呈细胞,通过表面提呈和旁分泌等两种方式和多信号通路刺激,在体内和体外有效扩增肿瘤抗原表位特异性的CTL细胞,并在体内与肿瘤抗原特异性CTL靶向接触,极大地提高其活化、增殖能力和杀伤活性,提高记忆性T细胞频率,抑制调节性T细胞扩增和抗原特异性CTL凋亡,促进炎性细胞因子释放和抑制调节性细胞因子的产生,通过上述多种免疫机制抑制肿瘤生长.MaAPCs治疗在一定程度上促进了机体的整体免疫功能,并对主要脏器无明显毒副作用.本研究为肿瘤的特异性主动免疫治疗提供了新的策略和新型免疫制剂.

著录项

  • 作者

    张雷;

  • 作者单位

    东南大学;

  • 授予单位 东南大学;
  • 学科 基础医学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 沈传来;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 R39;
  • 关键词

    多功能; PLGA; 微粒; 人工抗原提呈细胞; 肿瘤;

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号