三氯生对孕鼠和非孕鼠糖代谢的影响及其分子机制

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妊娠前糖代谢正常或有潜在糖耐量减退，妊娠期才出现糖尿病，被称为妊娠糖尿病。妊娠前已有糖尿病的患者妊娠，称糖尿病合并妊娠。糖尿病孕妇中80%以上为妊娠糖尿病，糖尿病合并妊娠者不足20%。目前，中国的妊娠糖尿病发生率已高达4.3-17.5%。妊娠糖尿病患者糖代谢多数于产后能恢复正常，但将来患2型糖尿病机会增加。持续性血糖水平增加会影响胎儿的发育，以及子代出生后的糖脂代谢。年龄、妊娠前肥胖以及家族糖尿病史已被证实是妊娠糖尿病发生的危险因素。近年来的研究开始关注环境因素对妊娠糖尿病发生的影响。三氯生（Triclosan,TCS），学名“二氯苯氧氯酚”，作为抑菌和抗菌剂被广泛使用在牙膏、护肤品、织物、塑料、护理清洁液，以及临床用品。流行病学资料显示，妊娠糖尿病患者尿中TCS水平明显高于正常妊娠人群。但是，妊娠期TCS暴露是否会影响糖代谢迄今还没有文献报道。有研究发现，非妊娠女性尿中TCS水平与甲状腺激素水平呈现负性相关。在非孕期或孕期的大鼠和小鼠，TCS暴露会引起血中四碘甲状腺氨酸（T4）和三碘甲状腺氨酸（T3）水平降低。流行病学资料显示，妊娠中期和晚期妊娠糖尿病的发生与低甲状腺激素相关，提示甲状腺功能减退是妊娠糖尿病发生的风险因素之一。葡萄糖转运体4（GLUT4）作为主要的胰岛素反应性葡萄糖转运体，将葡萄糖转入到胰岛素敏感的脂肪细胞和肌细胞等，进行能量代谢。甲状腺激素可以上调GLUT4的表达，从而提高细胞对胰岛素的敏感性，促进葡萄糖的摄取。我们研究室的前期研究已经发现，孕鼠TCS暴露会降低胎盘细胞葡萄糖转运体（GLUT2）的活性和表达。由于孕期的雌/孕激素水平增加，胎儿生长对葡萄糖的需求增加等因素会促使机体分泌更多的胰岛素以维持正常的糖代谢。因此，本课题提出孕期TCS暴露是否通过降低甲状腺激素水平能影响细胞对胰岛素敏感性和葡萄糖的摄取，影响糖代谢的科研设想。实验目的：阐明TCS暴露对孕鼠和非孕鼠糖代谢的影响及其分子机制。实验方法： 1.实验动物准备：（1）孕第5-17天的ICR小鼠分别给予1、4或8mg/kg的剂量进行TCS灌胃构建1-TCS孕鼠、4-TCS孕鼠、8-TCS孕鼠的染毒模型；（2）非孕鼠给予连续13天8mg/kg剂量TCS染毒，构建8-TCS非孕鼠模型；（3）给予等量茶油灌胃的孕鼠作为对照孕鼠（0-TCS孕鼠）和非孕鼠作为对照非孕鼠（0-TCS非孕鼠）模型。每天检查小鼠体重。在孕第17天进行糖代谢能力的检测。 2.用酶联免疫法（ELISA）检测血清中胰岛素水平，总T4（tT4）、游离T4（fT4）、总T3(tT3)、雌激素（E2）和孕酮（P4）水平。 3.空腹血糖水平检测：禁食12小时后从内眦取血。用葡萄糖氧化酶法检测血糖水平。计算HOMA-β指数——β细胞功能，HOMA-IR指数——胰岛素敏感性。 4.葡萄糖耐量实验（GTT）：禁食12小时后，腹腔注射2g/kg的葡萄糖，分别在葡萄糖注射前（0分钟）和葡萄糖注射后15、30、60、120分钟从尾静脉取血测量血糖水平，并计算曲线下面积（AUC）。 5.胰岛素耐量实验（ITT）：禁食6小时后，腹腔注射1U/kg的胰岛素，分别在胰岛素注射前（0分钟）和胰岛素注射后15、30、60、120分钟从尾静脉取血测量血糖水平，并计算曲线下面积（AUC）。 6.用10%的Bouin’s液固定胰腺组织，并进行石蜡包埋，切片。用胰岛素抗体进行胰岛免疫染色，计算光密度（IOD）。 7.蛋白印迹法（Western blot）检测肌肉和脂肪组织中Akt磷酸化（p-Akt），Akt和PPARγ蛋白水平。 8.实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测肌肉和脂肪组织中PPARγ和GLUT4的转录水平。 9.药物处理：L-T4按20ug/kg的剂量肌肉注射给药；PI3K抑制剂LY294002按10mg/kg的剂量腹腔注射给药；PPARγ激动剂罗格列酮（Rosiglitazone,rosi）按5mg/kg的剂量灌胃给药，对照组都被等量溶剂同样处理。实验结果： 1.与0-TCS孕鼠相比，8-TCS孕鼠的空腹血糖水平明显增加，而1-TCS和4-TCS孕鼠没有明显改变。8-TCS非孕鼠的空腹血糖水平与0-TCS非孕鼠相比没有差异。这些结果提示孕期8mg/kg的TCS处理引起糖代谢异常。 2.GTT结果显示，8-TCS孕鼠的葡萄糖清除时间比0-TCS孕鼠明显延长，1-TCS和4-TCS孕鼠没有明显改变。8-TCS非孕鼠与0-TCS非孕鼠没有差异。这些结果提示孕期8mg/kg的TCS处理引起葡萄糖耐量降低。 3.与0-TCS孕鼠相比，8-TCS孕鼠空腹胰岛素水平明显增加，但是1-TCS和4-TCS孕鼠没有明显改变。8-TCS非孕鼠和0-TCS非孕鼠的胰岛素水平基本相同。8-TCS孕鼠的胰岛素免疫染色IOD高于0-TCS孕鼠，并且HOMA-β低于0-TCS孕鼠。这些结果提示孕期8mg/kg的TCS处理引起β细胞功能增加。 4.ITT结果显示，8-TCS孕鼠在胰岛素注射后葡萄糖水平明显高于0-TCS孕鼠。并且8-TCS孕鼠的HOMA-IR高于0-TCS孕鼠。但是8-TCS非孕鼠没有明显改变。这些结果提示孕期8mg/kg的TCS处理引起胰岛素抵抗。 5.与0-TCS孕鼠相比，4-TCS孕鼠和8-TCS孕鼠显示剂量依赖的tT3、tT4和fT4水平减少，8-TCS非孕鼠血清中tT3、tT4和fT4水平也明显降于0-TCS孕鼠。而E2和P4水平在TCS孕鼠和非孕鼠都没有明显改变。 6.用甲状腺激素（L-T4，13天）处理8-TCS孕鼠能降低空腹血糖和胰岛素水平，恢复HOMA-β指数、HOMA-IR指数、葡萄糖耐量和胰岛素抵抗。 7.在8-TCS孕鼠肌肉和脂肪组织，PPARγ的mRNA和蛋白水平明显降低，而1-TCS孕鼠和4-TCS孕鼠与0-TCS孕鼠相比没有明显改变。L-T4处理8-TCS孕鼠能恢复PPARγ的表达，提示TCS通过减少甲状腺激素能抑制PPARγ的表达。 8.8-TCS孕鼠肌肉和脂肪组织Akt磷酸化水平下降，PPARγ激动剂（罗格列酮，rosi）或L-T4处理能增加8-TCS孕鼠的Akt磷酸化水平，提示TCS通过降低PPARγ表达减少Akt磷酸化。 9.8-TCS孕鼠肌肉和脂肪组织GLUT4的mRNA水平降低，L-T4处理能增加8-TCS孕鼠的GLUT4表达，但是rosi对GLUT4低表达没有作用，提示TCS通过减少甲状腺激素能抑制GLUT4的表达。 10.8-TCS非孕鼠肌肉和脂肪组织PPARγ和GLUT4的表达水平，以及Akt磷酸化与0-TCS非孕鼠相比没有改变。实验结论：（1）TCS暴露通过降低甲状腺激素水平能抑制孕鼠的肌肉和脂肪细胞PPARγ表达，引起Akt磷酸化和GLUT4表达降低，导致胰岛素抵抗，引起糖代谢异常——拟发生妊娠糖尿病。（2）虽然TCS暴露也能降低非孕鼠的甲状腺激素水平，但是不影响肌肉和脂肪细胞的PPARγ和GLUT4表达，Akt磷酸化，没有改变糖代谢功能和胰岛素敏感性。

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作者
华旭;
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作者单位

南京医科大学;

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授予单位南京医科大学;
学科生理学
授予学位硕士
导师姓名陈玲;
年度 2018
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正文语种中文
中图分类
关键词
三氯生; 孕鼠; 糖代谢;

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