UII/UT系统介导的急性肝损伤效应与枯否细胞自噬增加和凋亡减少有关

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目的：利用尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ，UII)受体（即UT）特异性拮抗剂urantide阻断UII/UT系统，探讨UII/UT系统对急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）过程中肝组织以及体外LPS刺激大鼠原代枯否细胞(Kupffer cell，KC)自噬水平的影响，以进一步阐明UII/UT系统在ALF过程中的作用机制。方法：体内实验：将健康雄性BALB/c小鼠随机分为A组：正常对照组LPS/D-GalN(-)urantide(-)；B组：预处理对照组LPS/D-GalN(-)urantide(+)；C组：模型组LPS/D-GalN(+)urantide(-)；D组：预处理模型组LPS/D-GalN(+)urantide(+)，每组6只（n=6）。其中B和D组给予urantide尾静脉注射预处理,A和C组给予生理盐水对照处理处理。30min后，C和D组立即LPS/D-GalN腹腔注射诱导急性肝损伤，A和B组给予相同剂量的生理盐水对照处理。腹腔注射6h后采集小鼠血液和肝组织样本。检测血清谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）水平。采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）对肝组织Beclin-1、自噬相关基因5（autophagy-related gene，Atg5）、微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated proteins1light chain3B，LC3）和p62mRNA进行相对定量检测，采用蛋白免疫印迹法（western-blot）对自噬相关蛋白LC3和p62进行检测。体外实验：经在体原位灌注、密度梯度离心和早期细胞换液等方法分离纯化SD大鼠原代KC，采用墨汁吞噬法鉴定细胞吞噬功能。将提取的KC随机分成A组：正常对照组LPS(-)urantide(-)；B组：预处理对照组LPS(-)urantide(+)；C组：模型组LPS(+)urantide(-)；D组：预处理模型组LPS(+)urantide(+)，每组实验重复6次（n=6）。其中B和D组加入urantide溶液预处理，A和C组给予相同剂量的无菌PBS对照处理。30min后,C和D组立即加入LPS溶液，A和B组给予相同剂量的无菌PBS对照处理，刺激6h后收集细胞。采用qRT-PCR检测细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF Receptor-Associated Factor6，TRAF6)、LC3和p62mRNA表达水平，采用Western-Blot检测TRAF6、LC3、p62、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和活化型半胱天冬酶-3（cleavedcaspase3）蛋白水平，采用活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒检测枯否细胞ROS水平。结果：体内实验显示：LPS/D-GalN刺激6h引起小鼠血清ALT和AST水平升高，C组较A、B组明显升高（均P＜0.01）；而urantide预处理后，D组较C组显著下降（P＜0.01）。此外，C组肝组织Beclin-1、Atg5、LC3和p62mRNA以及LC3-Ⅱ、p62蛋白水平较A、B组均明显下降（均P＜0.01）；D组上述指标较C组而言，均无显著变化，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。体外实验显示：LPS刺激原代KC6h，其炎症信号分子TRAF6和ROS水平明显增高，C组TRAF6mRNA和蛋白水平以及ROS水平较A、B组均显著上调（均P＜0.01）；而urantide预处理后，D组上述指标较C组均明显下调（均P＜0.01）。此外，C组KC自噬相关指标LC3和p62mRNA和蛋白水平较A、B组均明显上调（均P＜0.01）；而urantide预处理后，D组LC3mRNA和蛋白以及p62mRNA较C组明显下降，但p62蛋白水平进一步增高（均P＜0.01）。同时，C组KC抗凋亡Bcl-2蛋白水平较A、B组均明显下降，促凋亡cleaved caspase3蛋白水平较A、B组明显增高（均P＜0.01）；而urantide预处理后，D组Bcl-2水平较C组进一步下降，而cleaved caspase3水平较C组进一步增高（均P＜0.01）。结论：LPS/D-GalN诱导的ALF模型小鼠肝脏自噬水平明显下降，urantide预处理对ALF肝内自噬水平无影响。LPS能激活KC内炎症信号分子TRAF6，促使ROS产生，诱导KC自噬和凋亡水平的增高；而urantide预处理能抑制LPS引起的KC内TRAF6的增高和ROS的产生，同时抑制KC自噬的增高，促进KC的凋亡。因此，本研究表明UII/UT系统介导的ALF肝损伤效应与肝内抑制的自噬水平无关，但与KC自噬的增强和凋亡的抑制有关。

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作者
钟欢;
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作者单位

南京医科大学;

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授予单位南京医科大学;
学科内科学(传染病)
授予学位硕士
导师姓名刘亮明;
年度 2018
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病虫害及其防治;
关键词
系统; 介导; 损伤效应; 细胞自噬;

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