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1.表皮生长因子调节SERT表达及其在内脏高敏感形成中的作用探讨;2.GLP--1受体激动剂exendin--4通过对SERT表达的调控影响内脏高敏感形成

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第一部分 表皮生长因子调节SERT表达及其在内脏高敏感形成中的作用探讨

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 GLP-1受体激动剂exendin-4通过对SERT表达的调控影响内脏高敏感形成

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 5-羟色胺转运体在肠道疾病中的研究进展

个人小结

致谢

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摘要

本研究分为两部分。 第一部分表皮生长因子调节SERT表达及其在内脏高敏感形成中的作用探讨 肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一种以腹痛或腹部不适为主要表现的功能性肠病，其发病机制尚未完全清楚，目前认为主要与内脏高敏感性及胃肠动力异常相关。多项研究证实内脏高敏感性与高水平的5-羟色胺(serotonin，5-hydroxytryptamine，5-HT)密切相关，5-羟色胺转运体(serotonintransporter，SERT)主要表达在肠上皮细胞膜、神经元突触等，对5-HT再摄取及灭活发挥作用，SERT其表达及功能异常可能是导致内脏高敏形成的重要机制。近期有学者发现表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)可在转录水平调控人肠上皮细胞SERT的表达及5-HT再摄取功能。而EGF与内脏高敏感形成的关系至今未明。本课题旨在通过乳大鼠醋酸灌肠建立慢性内脏高敏感模型，研究5-HT、SERT、EGF在内脏高敏感大鼠外周血及结肠组织中的表达，并分析EGF水平与SERT表达之间的关系。体外实验中进一步研究EGF对肠上皮细胞SERT表达及5-HT再摄取的影响。初步探讨EGF对SERT表达影响及其与内脏高敏感之间关系。 目的: 1.检测内脏高敏感大鼠结肠及血清中EGF表达，并分析结肠组织中EGF水平与SERT表达间关系。 2.应用大鼠肠上皮细胞系（IEC-6细胞）进一步探讨EGF对SERT表达及5-HT再摄取的影响及其可能机制。 方法： 1.分组:新生Sprague-Dawley雄性乳大鼠20只，随机分成对照组，模型组，每组各10只。模型组大鼠于出生后第10-21天予以0.5％醋酸0.2ml灌肠，每日1次，为减少生理节律影响，均采用上午8:00进行灌肠，对照组大鼠每日予以相同体积生理盐水灌肠。 2.验证成模:大鼠成长至第8周，行电极置入术，术后恢复1周，通过予以不同压力结直肠扩张(colorectal distension, CRD)刺激下，观察腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分及记录腹外斜肌肌电活动(electromyography, EMG)评估内脏敏感性。HE染色评估模型鼠及对照鼠结肠炎性改变情况。 3.第9周观察AWR评分及记录EMG评估内脏敏感性;HE染色评估大鼠结肠炎症情况;ELISA方法检测对照组及模型组大鼠结肠及血清中5-HT及EGF含量;Western blotting法检测对照组及模型组大鼠结肠中SERT蛋白表达，并分析其与结肠中EGF含量的相关关系。 4.细胞培养:大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6培养于10％ FBS的高糖DMEM培养基。 5.EGF对大鼠IEC-6细胞上SERT表达及再摄取5-HT功能的影响:IEC-6细胞经不同浓度和不同时间EGF刺激后，以qRT-PCR、Western blotting分别检测IEC-6细胞上SERT的mRNA和蛋白水平。为进一步证实EGF调控SERT作用是否通过其EGFR发挥作用，给予EGFR特异性抑制剂PD153035预先刺激，再给予EGF刺激后检测SERT蛋白及再摄取5-HT功能改变。 结果: 1.内脏高敏感大鼠模型:与对照组大鼠相比，模型组大鼠在CRD刺激压力为40、60mmHg时，其AWR评分明显增高;在CRD刺激压力为40、60、80mmHg下，模型组大鼠EMG曲线下面积明显高于对照组; HE染色两组大鼠结肠组织均未见明显炎症改变。以上结果显示内脏高敏感模型建立。 2.与对照组相比，模型组大鼠血清及结肠组织中5-HT水平明显增高(P＜0.05)，结肠组织中SERT蛋白表达下降;模型组大鼠血清及结肠组织中EGF含量明显低于对照组，并且通过Pearson's方法对大鼠结肠组织中EGF含量及SERT蛋白表达量进行相关性分析发现两者存在显著正相关(r=0.820，P＜0.001)。 3.EGF可促进IEC-6细胞SERT mRNA和蛋白表达，以EGF浓度为40ng/L作用最为显著;在EGF(40ng/L)作用不同时间点，SERT表达的高峰时间为24h和48h。予以EGF(40ng/L)刺激IEC-6细胞24h，其氚标5-羟色胺(3H-5-HT)摄取率明显高于对照组(P=0.021)。 4.予以EGF(40ng/L)刺激IEC-6细胞24h，其氚标记5-羟色胺（3H-5-HT）摄取率明显高于对照组(P=0.021)。 5.予EGFR特异性抑制剂预处理后加入EGF，SERT蛋白表达减低且3H-5-HT摄取率显著低于EGF组。 结论： EGF可影响SERT表达及5-HT再摄取降低，内脏高敏感大鼠EGF表达减低影响SERT表达，从而参与内脏高敏感形成。 第二部分 GLP-1受体激动剂exendin-4通过对SERT表达的调控影响内脏高敏感形成 背景： 肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹痛及腹部不适为主要表现的常见的功能性肠病。目前IBS发病机制不明，治疗方法也较为局限，GLP-1受体激动剂能有效缓解IBS患者的腹痛，但缓解IBS患者腹痛的机制不明。Exendin-4是天然的GLP-1受体激动剂，血浆半衰期较长，达2.4小时。5-HT(5-hydroxytryptamine，5-HT)作为一种重要的神经递质，在内脏感觉的传递及调控中起着重要的作用，5-羟色胺转运体(serotonin transporter，SERT)是其灭活途径中重要的转运蛋白，可将5-HT摄取胞内进行降解。我们前期实验发现exendin-4可有效缓解内脏高敏感大鼠的内脏敏感性，该作用可能是通过促进肠上皮细胞SERT的表达进而促进5-HT再摄取降解途径实现。研究发现cAMP-PKA信号通路可调控SERT基因表达。因此本实验进一步通过探讨exendin-4是否是通过cAMP-PKA影响大鼠肠上皮细胞SERT的表达，进而影响5-HT功能。 目的： 采用大鼠肠上皮细胞系IEC-6细胞，探讨exendin-4对IEC-6细胞SERT表达及对5-HT再摄取功能，并进一步分析该作用可能胞内分子机制。 方法： 1.IEC-6细胞培养:培养于10％ FBS的高糖DMEM培养基。 2.Exendin-4对IEC-6细胞上SERT表达的影响:经不同浓度和不同时间点exendin-4刺激后，以qRT-PCR、Western blotting、氚标记的5-HT（3H-5-HT）同位素实验分别检测IEC-6细胞上SERT的mRNA和蛋白水平以及5-HT再摄取率。 3.GLP-1受体抑制剂exendin-9对SERT表达的影响:IEC-6细胞经exendin-9预先处理后，Western blotting检测SERT蛋白改变。 4.分别给予信号通路相关因子预处理IEC-6细胞，采用PKA活性检测试剂盒检测细胞内PKA活性，Western blotting检测SERT蛋白改变。 结果： 1.Exendin-4呈浓度及时间依赖的增加IEC-6细胞上SERT蛋白及mRNA表达，并且能够促进细胞再摄取5-HT。 2.GLP-1受体抑制剂exendin-9预处理后，IEC-6细胞SERT蛋白表达显著低于exendin-4组。 3.腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)激动剂Forskolin可显著促进IEC-6上SERT蛋白表达，作用基本与exendin-4一致，而在预先给予AC抑制剂SQ22536和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)抑制剂H89处理细胞后，其SERT蛋白表达显著低于exendin-4组。 4.Forskolin及exendin-4刺激细胞后，其胞内PKA活性显著增加，而预先给予SQ22536及H89组细胞内的PKA活性显著低于exendin-4和Forskolin组。 结论： Exendin-4可通过AC-cAMP-PKA信号通路促进肠上皮细胞上SERT蛋白表达，且可促进细胞对5-HT再摄取功能。

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