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热休克蛋白90介导的放射性分子探针对人非小细胞肺癌靶向治疗的实验研究

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绪论

文献综述

第一章 热休克蛋白90作为非小细胞肺癌分子靶点的可行性研究

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第二章 热休克蛋白90抑制剂17-AAG的核素标记和体外活性分析

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第三章 放射性分子探针在小动物活体内的实验研究

1. 前言

2. 材料与方法

3. 实验结果

4. 讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢

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摘要

研究目的：分子伴侣热休克蛋白90（Heat shock protein90，HSP90）作为热休克蛋白家族成员之一，在肿瘤细胞的存活过程中有非常重要的作用，是肿瘤治疗的一个有效靶点。研究放射性131I标记17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-allylamino-17-demethoxygeldanamy-cin，17-AAG）在体内、外生物活性分析，探讨核素标记HSP90抑制剂对人非小细胞肺癌靶向治疗潜力。
　　 研究方法：1.H460、A549、SPC-A-1三种非小细胞肺癌及EC-304正常人内皮细胞培养扩增后，间接细胞免疫荧光染色和western blot分析观测三种非小细胞肺癌细胞上HSP90表达情况，以正常EC-304细胞作对照；加入不同浓度17-AAG（0、15、30、60、120 nM）干预细胞，计算存活细胞率和72h半数抑制率（IC50），比较不同细胞株对药物的敏感性。2.双氧水法制备131I（125I）-17-AAG，观察放射性标记探针体外稳定性和生物活性，放射性受体-配体饱和实验测定125I标记17-AAG与不同细胞株结合的平衡解离常数（Kd）和最大结合位点容量（Bmax）；MTT法比较四种给药方式对细胞生长抑制作用，包括17-AAG（1μg）、Na131I（740kBq）、131I-17-AAG（185 kBq、370 kBq、740 kBq和1480kBq）、和17-AAG（1μg）+131I-17-AAG（740kBq）联合给药，并用流式细胞术分析对细胞凋亡率和细胞周期变化的影响。3.荷H460非小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤模型建立。体内分布实验：24只荷瘤鼠分间质注射或尾静脉注射131I-17-AAG（每只1.85MBq/0.1mL），分别于0.5h、4h、24h和1w处死，取血和主要组织脏器测放射性计数率值；体内显像实验：12只荷瘤鼠随机分为4组（n=3），包括131I-17-AAG间质给药组、静脉给药组、Na131I间质给药对照组及竞争性显像组，放射性给药剂量为每只5.55MBq，0.1mL，并且竞争性显像组提前2h予未标记17-AAG200μg，行SPECT显像观察；治疗实验：28只荷瘤裸鼠随机分为7组（n=4），间质和尾静脉注药各3组，剂量依序为5.5MBq×2、11.0MBq和5.5MBq，另设空白对照组。观察16d后处死，做光镜、电镜及免疫组化检测；Western blot检测瘤体组织治疗后HSP90及EGFR表达改变。
　　 研究结果：1.免疫荧光染色和western blot结果显示三种非小细胞肺癌H460、A549、SPC-A-1细胞均存在HSP90阳性表达，正常人内皮细胞EC-304亦存在少量表达；17-AAG作用72h后对各肺癌细胞H460、A549、SPC-A-1半数抑制浓度依序为28.01nM、23.14 nM和26.54nM，均远低于EC-304=的半数抑制浓度769.8nM。2.放射性标记探针131I-17-AAG放射化学纯度>96.51％，4℃放置，体外保持较好的稳定性。标记探针与H460细胞上HSP90受体靶向结合特异性相对最高，为Kd=1.272nmol/L，而A549细胞膜上HSP90所需最大结合容量最多，为Bmax=0.086pmol/105个细胞，正常人内皮细胞结合饱和曲线呈非特异性结合。131I-17-AAG组对肿瘤细胞杀伤作用较17-AAG组明显（72h tH460=9.89，tA549=12.58和tSPC-A-1=10.84，均P<0.05）。17-AAG+131I-17-AAG联合治疗抑制效应显著，17-AAG具有一定的放射增敏效应。3.体内显像提示间质注射131I-17-AAG瘤体内放射性浓聚明显并长时间滞留，体内分布实验结果亦予证实；尾静脉给药瘤体内存在一定放射性摄取，药物体内清除较快；Na131I注射后迅速排出体外，无瘤内滞留；竞争性显像示瘤内摄取降低，标记探针与瘤组织为特异性结合。形态学观察显示131I-17-AAG的治疗抑瘤效应最好，瘤组织破坏最明显，优于静脉给药组。免疫组化显示间质及尾静脉注药组HSP90、Ki-67、Bcl-2阳性率均较对照组下降（统计值依次为HSP90 t间质=19.09和t静脉=6.10；Ki-67 t间质=11.54和t静脉=7.19；Bcl-2 t间质=11.27和t静脉=6.33，均P<0.05）；Western blot结果显示随抑瘤作用增加，HSP90和EGFR蛋白表达降低。
　　 研究结论：1.肺癌细胞对HSP90抑制剂17-AAG敏感性明显高于正常细胞，HSP90可以作为非小细胞肺癌治疗研究的有效靶点。2.放射性标记探针131I-17-AAG具有良好的体外生物学活性，131I-17-AAG对肺癌治疗较单纯17-AAG有明显增强作用，17-AAG亦具有一定的放射增敏效应。3.131I-17-AAG可以抑制表皮生长因子受体（EGFR）表达，可以增加EGFR耐受的肿瘤对相关化疗药物的敏感性。4.131I-17-AAG体内特异性靶向瘤体组织，能有效抑制裸鼠非小细胞肺癌的生长，以间质注药及间隔给药抑癌效应最佳，核素标记HSP90抑制剂对非小细胞肺癌治疗有较好应用前景。

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