乳液PCR技术在构建ssDNA文库和P16基因甲基化、HBV DNA检测中的初步应用

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乳液PCR是单分子PCR技术，通过油相的阻隔，把水相间隔成数目庞大的小水滴，这些小水滴构成了独立的PCR反应空间，最理想的状态下每个小水滴中只含有1个DNA模板，此时小水滴中的PCR反应不会受到竞争干扰。
　　乳液PCR的优点是:(1)抗干扰能力强;(2)能消除竞争抑制;(3)高通量和高效率;(4)灵敏度高;(5)绝对定量。
　　本课题利用乳液PCR的特点，建立了高效构建次级ssDNA文库的乳液不对称PCR和乳液单引物PCR方法。同时还建立了用于临床检验诊断的高灵敏度的两步乳液PCR法，并用初步应用到结直肠癌患者血清游离P16基因甲基化水平和乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒核酸的检测中。
　　第一部分、建立和优化乳液不对称PCR高效构建随机ssDNA文库
　　目的:建立并优化乳液不对称PCR来构建ssDNA次级文库。
　　方法:乳液不对称PCR通过乳液颗粒把不同种类的模板隔开形成单分子PCR，每个模板分开扩增互不影响，不会形成非特异性杂交。以ssDNA文库为模板的乳液不对称PCR100μl体系含50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.6)，2.5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.4μmol/L上游引物、0.02μmol/L下游引物、0.04μg/mL模板和0.1U/μL pfu DNA聚合酶。优化实验时，模板浓度优化范围从0.0004μg/mL到40μg/mL，上游引物浓度从0.2μmol/L到1μmol/L，下游引物浓度从0.0025μmol/L到0.02μmol/L。扩增反应条件为94℃变性30s，然后进入35个循环94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸30s，最后延伸3min。优化循环数从10到50个循环。扩增结束破乳液回收产物，并进行聚丙烯酰氨凝胶电泳和银染，对产物进行分析。对破乳液回收产物同时进行纯化回收，并用磁珠分离出ssDNA文库，检测浓度。同时对乳液不对称PCR与常规不对称PCR进行对比研究。
　　结果:常规不对称PCR扩增ssDNA文库，在25个循环即有明显副产物出现，30个循环时出现明显的涂抹带，25个循环后dsDNA产物量随着循环数的增加逐渐减弱，只至消失，后期不对称PCR扩增无模板可用，只有非特异性扩增，只产生非特异性产物。因为25个循环即有明显副产物出现，用磁珠分离的ssDNA文库不纯，因此只分离检测10、15和20个循环时的浓度，分别为0.76，1.43和2.02μg/mL。乳液不对称PCR在从10到50个循环中均无副产物，只有ssDNA条带和dsDNA条带，且dsDNA条带无明显减少，磁珠分离10、15、20、25、30、35、40、45和50循环数的产物浓度分别为0.58、1.22、1.78、2.25、3.21、4.32、6.43、6.71和6.55μg/mL产物量明显多于常规不对称PCR。
　　在优化乳液不对称PCR时，首先优化模板浓度。当模板浓度从0.0004μg/mL到0.04μg/mL时产物量随模板浓度增高而增多，再增加模板浓度产物量无明显变化，当模板浓度为4μg/mL时，副产物与产物呈涂抹带，无法分离。模板浓度为0.04～0.4μg/mL时，无肉眼可见副产物，ssDNA产物量也足够多，在模板浓度为0.4μg/mL时，dsDNA浓度明显下降。因此模板浓度在0.04μg/mL到0.4μg/mL范围内均可。
　　在优化引物浓度时，不仅优化了上下游引物浓度比，还优化了上下游引物的量。不对称PCR的产物是ssDNA，因此当引物浓度过高时，易与已形成的ssDNA杂交进行非特异性扩增，所以我们首先优化浓度较高的上游引，上游引物浓度从0.2～1μmol/L时，产物量无明显变化，当上游引物浓度为0.6μmol/L时有少量副产物，为1μmol/L时有大量副产物生成。因此上游引物浓度在0.2～0.4μmol/L范围内均可。以0.4μmol/L为上游引物浓度，优化下游引物浓度时，下游引物浓度从0.0025～0.02μmol/L时产物量逐渐上升且无副产物，因此选择下游引物0.02μmol/L为最佳浓度。
　　结论:乳液不对称PCR，不需要优化循环数，不会出现常规不对称PCR由过度扩增引起的副产物问题，只需通过简单模板浓度和引物浓度优化，就能得到高质量的ssDNA文库。该法能简单、方便、高效的构建ssDNA文库，用于适配子的筛选对筛选效率提高有一定的帮助。
　　第二部分、乳液单引物PCR构建次级ssDNA文库方法的建立及优化
　　目的:建立并优化乳液单引物PCR扩增法构建随机ssDNA文库。
　　方法:构建90 bp的随机寡核苷酸文库，运用乳液PCR扩增出双链DNA文库，再以双链DNA文库为模板，分别用乳液单引物PCR和常规单引物PCR扩增构建ssDNA文库，并进行比较。乳液单引物PCR100μl体系含50mmol/LKCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.6),2.5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.75μmol/L上游引物、9pmol/L模板和0.1U/μL pfu DNA聚合酶。优化实验时，模板浓度从1pmol/mL到18pmol/mL，上游引物浓度从0.5到3μmol/L，DNA聚合酶浓度从0.075U/μL到0.175U/μL，dNTP浓度从0.25到1.25mmol/L。反应条件为94℃变性30s，然后进入35个循环94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸30s，最后延伸3min。优化退火温度时，温度从50℃到70℃。优化循环数从10到35个循环。
　　结果:乳液PCR可以高质量的把ssDNA转化成dsDNA。常规单引物PCR扩增构建随机ssDNA文库，发现15个循环时就有明显副产物出现，在20个循环时目的产物和副产物已经融合成涂抹带，无法分离;乳液单引物PCR在10～35个循环均无副产物，且产物量明显高于单引物PCR。作为模板的dsDNA在常规单引物PCR扩增过程中随循环数的增加逐渐减少，到25个循环即消失，而乳液单引物PCR的模板量在10～35个扩增循环中无明显减少。在优化乳液单引物PCR时，首先优化模板浓度，当它从18pmol/mL到1pmol/mL时，产物量迅速下降，到1pmol/mL时产物几乎降到0，模板浓度对产物量影响最大。引物浓度对副产物的影响最大，退火温度同时影响产物与副产物的量。酶浓度大于0.1U/μL出现副产物，dNTP浓度对扩增影响相对较小。
　　结论:乳液单引物PCR构建随机ssDNA文库同样不需要优化循环数，无过度扩增产生的副产物。因为乳液单引物PCR模板为ssDNA通过PCR扩增得到dsDNA，模板量足够，而乳液不对称PCR所用的模板为筛选过程中直接洗脱的ssDNA，所以乳液单引物PCR在模板量的选择上更有优势，因此该法也可高效的构建ssDNA文库。
　　第三部分、两步乳液PCR的建立及在结直肠癌患者p16基因甲基化检测中的初步应用
　　目的:建立检测P16基因甲基化的两步乳液PCR方法，并初步应用在结直肠癌患者血清中P16基因甲基化检测。
　　方法:分别构建含甲基化和非甲基化P16基因序列的质粒，转入大肠杆菌DH5α感受态细菌;建立两步乳液PCR方法:(1)油包水乳液PCR:用0.1ml的反应体系(10mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、0.2mmol/LMgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1％TritonX-100、0.5mmol/L dNTP、0.2μmol/L引物、4ul菌液模板和0.1U/μL pfu DNA聚合酶），制备乳液后分装100μl/管，立即进行PCR扩增。反应条件为94℃变性5min，然后进入15个循环94℃变性30s、甲基化为69℃（非甲基化为65℃）退火60s、72℃延伸60s，最后延伸3min。(2)水包油乳液PCR:油包水乳液PCR扩增结束后，14，000rpm离心10min，去上层油相，加入33μl PCR反应体系(10mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、0.2mmol/L MgSO4、16mmol/L(NH4)2SO4、0.1％TritonX-100、0.5mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物和0.1U/μLpfu DNA聚合酶），充分震荡混匀，制成水包油乳液颗粒，放入PCR仪按上述扩增条件扩增35个循环。分别应用甲基化特异性PCR和两步乳液PCR检测含不同浓度的甲基化和非甲基化P16基因序列的菌液，比较两种方法的特点。分别检测36例结直肠癌患者和25健康体检者血清中p16基因的甲基化情况。
　　结果:灵敏度实验和干扰实验结果显示，两步法乳液PCR比MSP具有更高的灵敏度和更强的抗干扰能力。两步法乳液PCR的检测灵敏度是MSP的10倍。在非甲基化基因的干扰下，两步法乳液PCR能在甲基化与非甲基化比例为1∶100的情况下检测出甲基化，而MSP只能在甲基化与非甲基化比例为1∶10的情况下检测出甲基化。在检测结直肠癌患者血清中p16基因的甲基化时，两步法乳液PCR的检出率为55.5％，而MSP检出率只有44.4％。
　　结论:两步乳液PCR在检测P16基因甲基化时，表现出较高的灵敏度和抗干扰能力，在临床检测实验中比MSP检出率更高，可应用于临床肿瘤的早期诊断。
　　第四部分、两步乳液PCR检测乙型肝炎病毒核酸方法的建立及初步应用
　　目的:建立两步乳液PCR检测乙型肝炎病毒核酸方法，并初步应用于临床。
　　方法:选取乙型肝炎病毒核酸定量检测结果＜500IU/mL的标本78例，应用荧光定量PCR法检测并选取无扩增曲线的标本。再分别用普通PCR和用两步乳液PCR检测乙肝病毒核酸，并用ELISA检测乙肝病毒血清标志物。
　　结果:无扩增曲线的40例中，通过两步乳液PCR有14例(35％)为阳性，而常规PCR都为阴性。40例标本中有27例为乙型肝炎病毒表面抗原阳性同时e抗原阴性，即临床诊断为非活动性乙型肝炎病毒表面抗原阳性携带者，而这27例中有10例可通过两步乳液PCR检测出乙型肝炎病毒核酸。
　　结论:两步乳液PCR体系较荧光定量PCR有较高的检测灵敏度，能进一步检测定量结果＜500 IU/mL的病人血清中是否有乙肝病毒，可作为临床荧光定量PCR的补充检测手段，为临床乙肝的诊疗提供依据。

著录项

作者
邵可可;
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作者单位

江苏大学;

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授予单位江苏大学;
学科临床检验诊断学
授予学位博士
导师姓名邵启祥;
年度 2017
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正文语种中文
中图分类微生物学检验;生物化学技术;
关键词
乳液PCR; ssDNA文库; P16基因甲基化; 乙型肝炎病毒; 核酸检测;

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