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幽门螺杆菌cag致病岛cagS基因功能的研究

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第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 幽门螺杆菌简述

1．1．2 幽门螺杆菌致病机制的研究现状

1．1．3 幽门螺杆菌cagPAI研究现状

1．1．4 幽门螺杆菌cagPAI编码的T4SS研究现状

1．2 本研究的目的、内容及技术路线

1．2．1 研究目的

1．2．2 研究内容

1．2．3 技术路线

第二章 幽门螺杆菌cagS基因的原核表达及其抗血清体制备

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要溶液的配制

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 H．pylori的培养与鉴定

2．2．2 H．pylori基因组DNA的抽提

2．2．3 PCR引物的设计

2．2．4 cagS基因片段的回收

2．2．5 制备E．coli DH5α感受态细菌

2．2．6 载体和目的片段的连接

2．2．7 连接产物转化DH5α感受态细菌及筛选

2．2．8 重组质粒的提取与鉴定

2．2．9 表达载体的构建

2．2．10 目的基因cagS的诱导表达

2．2．11 重组蛋白CagS的可溶性分析

2．2．12 重组表达蛋白CagS的纯化

2．2．13 重组纯化蛋白的复性与浓缩

2．2．14 重组纯化蛋白的SDS-PAGE及Western Blot分析

2．2．15 抗重组CagS蛋白抗血清的制备及效价测定

2．3 结果

2．3．1 H．pylori的分离培养与鉴定

2．3．2 cagS基因编码蛋白的信号肽预测

2．3．3 H．pylori cagS基因片段的PCR扩增

2．3．4 重组表达质粒的鉴定

2．3．5 目的蛋白的诱导表达与鉴定

2．3．6 目的蛋白的可溶性分析

2．3．7 目的蛋白的纯化、复性及浓缩

2．3．8 多克隆抗血清的效价测定

2．4 讨论

第三章 幽门螺杆菌cagS基因缺失株的构建

3．1 材料

3．1．1 载体与菌株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要溶液

3．1．4 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 细菌的培养

3．2．2 cagS基因上下游同源臂的扩增

3．2．3 重组自杀质粒的构建和鉴定

3．2．4 制备H．pylori感受态细胞

3．2．5 cagS基因缺陷株的构建

3．3 结果

3．3．1 cagS基因上下游同源臂的PCR扩增

3．3．2 cagS基因缺陷重组自杀质粒的构建

3．3．3 cagS基因缺陷株的鉴定

4．4 讨论

第四章 cagS蛋白的亚细胞定位及其互作蛋白的研究

4．1 方法

4．1．1 菌株、质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要溶液配制

4．1．4 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 H．pylori培养

4．2．2 H．pylori分离组分及亚细胞定位

4．2．3 细菌双杂交实验筛选与CagS蛋白具有相互作用的蛋白

4．2．4 cagS基因缺失对其它重要cag致病岛编码蛋白合成的影响

4．3 结果

4．3．1 CagS蛋白的亚细胞定位

4．3．2 通过细菌双杂交筛选CagS蛋白的互作蛋白

4．3．3 cagS基因缺失对其它重要cag致病岛编码蛋白合成的影响

4．4 讨论

第五章 cagS基因对Ⅳ型分泌系统转运CagA以及诱导细胞分泌IL-8的影响

5．1 材料

5．1．1 质粒、菌株及细胞株

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要溶液配制

5．1．4 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 H．pylori培养与细胞培养

5．2．2 Real-Time PCR引物设计

5．2．3 标准质粒的构建及验证

5．2．4 总RNA的提取与逆转录

5．2．5 总蛋白提取

5．2．6 CagA蛋白转运实验

5．2．7 Real-Time PCR检测H．pylori cagA mRNA表达检测

5．2．8 Real-Time PCR检测H．pylori诱导IL-8 mRNA的表达检测

5．2．9 ELISA法检测IL-8蛋白分泌的检测

5．3 结果

5．3．1 CagA蛋白转运与cagA mRNA的表达

5．3．2 IL-8 mRNA的表达与IL-8蛋白的分泌

5．4 讨论

第六章 主要结论及展望

6．1 主要结论

6．2 主要展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文和参加的课题

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摘要

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是人类消化道疾病、特别是胃部疾病最主要的致病菌之一，为革兰阴性螺旋形微需氧菌，其长期定植于人类胃粘膜，世界范围内的感染率达已达到50％。现已证实，诸如消化性溃疡、慢性胃炎、胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤甚至胃癌等多种胃肠道疾病的发生皆与H.pylori感染密切相关。Ⅰ型H.pylori菌株因携带cag致病岛(cag pathogenicityisland，cag PAI)而致其毒性较强。H.pylori重要的毒力因子:细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A，CagA)由cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统转运进入宿主细胞内，使其功能紊乱。研究至今，已经可以确定cag致病岛中含有27个基因，并且世界范围内的专家学者们对其进行了全面的探索研究，但时至今日仍有大部分基因与其编码的蛋白质的功能及其致病机理尚未完全明确。本文以cag致病岛中的cagS基因作为研究对象，通过微生物学、免疫学和分子生物学等技术探讨其功能，为进一步研究cag致病岛的致病机制和功能奠定基础。
　　方法:
　　1.H.pylori26695全基因序列来自于Genbank，经生物信息学软件:SignalP4.1 server对其信号肽进行预测分析，使用Primer Premier6.0设计去信号肽后的cagS基因引物，并构建原核表达载体pET-30a-cagS，转化入表达工程菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后，确定蛋白可溶性，大量诱导后，使用QIAGEN系统Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白。并进一步通过复性浓缩，获得具有蛋白功能的CagS融合蛋白。使用SDS-PAGE电泳、Western blot等技术分析和鉴定目的蛋白。
　　2.将纯化后的CagS融合蛋白免疫小鼠，制得鼠抗CagS多克隆抗血清，利用酶联免疫吸附试验测定抗血清效价。
　　3.利用同源重组原理，设计PCR引物并扩增cagS基因上下游同源臂片段，构建cagS基因缺陷自杀质粒pBlueM40-△cagS::kan，通过电转化使其进入H.pyloriNCTC26695中，通过抗性筛选出阳性克隆，并使用PCR方法、基因测序方法以及Western blot分析验证后，即获得cagS基因缺陷株，并以野生株为对照，对其生长情况与尿素酶的分泌功能进行检测。
　　4.收集并裂解菌体，采用超高速低温离心法进行亚细胞分离，包括膜蛋白（包括内膜和外膜）、胞质蛋白及周质间隙蛋白，利用Western Blot技术，以鼠抗CagS多克隆抗血清为一抗，检测CagS蛋白亚细胞定位。
　　5.将cagS基因缺陷株与NCTC26695野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后，分别提取细胞与细菌mRNA，对细胞IL-8以及细菌cagA的表达量进行检测;提取细胞蛋白，检测CagA蛋白转运量，研究cagS基因缺陷对CagA蛋白转运的影响;收集培养液上清，对细胞的IL-8分泌量进行检测。
　　6.收集cagS基因缺陷株与NCTC26695野生株，裂解后得到细菌全菌蛋白，使用Western blot方法分别检测cag致病岛重要编码蛋白Cagξ、CagX、CagM、CagL和CagI的表达量，研究cagS基因的缺失是否会对这些蛋白的合成与稳产生影响。
　　7.利用细菌双杂交体系，寻找cag致病岛中与cagS基因有相互作用的可疑基因。
　　结果:
　　1.H.pylori NCTC26695菌株cagS基因全长为591bp，其相对分子质量约为21kDa。预测该蛋白存在信号肽，位置在N端的前21个碱基，在21至22的位置处断裂。
　　2.成功构建原核表达载体pET-30a-cagS，通过原核表达，获得大量目的蛋白CagS。并通过QIAGEN系统纯化目的蛋白并免疫小鼠并制备鼠抗CagS多克隆抗血清，效价为1∶51200。
　　3.成功构建cagS基因敲除重组自杀质粒:pBlueKM40-△cagS::kan。通过电转化技术使自杀质粒进入H.pylori NCTC26695菌体内，并利用卡那霉素抗性筛选出同源重组成功的菌株，即为H.pylori cagS基因缺陷株:△cagS。通过酶切验证、PCR以及对PCR产物进行测序的方法进行了验证。
　　4.以鼠抗cagS多克隆抗血清为一抗作Western blot分析，确定CagS位于菌体膜部分;H.pylori与GES-1细胞共培养，检测cagA mRNA表达量与CagA蛋白转运量，结果显示cagS基因缺陷株的cagA mRNA表达量与CagA转运量与野生株无异，同时检测细胞的IL-8mRNA表达量与IL-8的分泌量，结果显示cagS基因缺失株诱导IL-8表达与分泌的能力明显下降;比较H.pylori野生株和cagS基因缺陷株中五种已知Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达量。结果显示CagI、CagX、CagM、CagL和CagI蛋白表达水平没有明显差异。
　　结论:
　　1.成功构建了cagS基因原核表达载体pET-30a-cagS，并获得目的融合蛋白CagS，免疫小鼠后，获得了鼠抗CagS蛋白的多克隆抗血清。
　　2.成功构建了自杀质粒pBlueKM40-△cagS::kan，并且获得了一株cagS基因缺陷株△cagS。
　　3.初步确定了CagS蛋白的亚细胞定位，位于菌体膜部位;证明了cagS基因缺失并不会影响H.pylori cagA mRNA的表达，也不影响其CagA蛋白转运的能力;证明了cagS基因的缺失会降低H.pylori诱导宿主细胞表达及分泌IL-8的能力;证明了cagS基因缺失对Cagl、CagM、CagL、CagX和CagI这五种Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达和稳定没有影响。

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