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抗瓜氨酸化蛋白特异性免疫复合物在类风湿关节炎中的作用

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第一章 绪论

1.1 瓜氨酸化与RA

1.2 成纤维样滑膜细胞(FLSs)与RA

1.3 细胞因子与RA

1.4 本研究的目的、方法、实验设计、意义

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究方法

1.4.3 实验设计

1.4.4.研究意义

第二章 ACPA-IC ELISA检测技术的建立

2.1 材料

2.1.1 研究对象

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液的配制

2.1.4 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 PEG沉淀法

2.2.2 ACPA-IC ELISA检测法

2.2.3 其他指标检测

2.2.4 统计学分析

2.3 结果

2.3.1 RA患者血液免疫学实验指标检测结果

2.3.2 ACPA-IC ELISA方法学评估

2.3.3 临床检测结果

2.3.4.ACPA-IC与ACPA等实验指标相关性分析

2.4 讨论

第三章 ACPA-IC特异抗原的鉴定及对FLS功能影响的研究

3.1 材料

3.1.1 标本来源

3.1.2 主要试剂

3.1.3 溶液的配制

3.1.4 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 血清ACPA-IC测定

3.2.2 G蛋白免疫亲和层析法

3.2.3 SDS-PAGE

3.2.4 Western blot

3.2.5 FLSs培养

3.2.6 FLSs传代

3.2.7 间接免疫化学染色法

3.2.8 细胞增殖检测

3.2.9 FLSs细胞分泌IL-8的测定

3.3 结果

3.3.1 血清ACPA-IC测定

3.3.2 IC纯化及鉴定

3.3.3 Western-blotting检测

3.3.4 FLS细胞形态学观察

3.3.5 间接免疫化学染色法(ICA)检测

3.3.6 ELISA检测ACPA-IC结果

3.3.7 ACPA-IC刺激对FLSs增殖功能的影响

3.3.8 ACPA-IC刺激对FLSs分泌IL-8功能的影响

3.4 讨论

主要结论及展望

主要结论

展望

参考文献

致谢

综述

参考文献

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摘要

目的:建立检测血清抗瓜氨酸蛋白自身抗体(ACPA)特异性免疫复合物(ACPA-IC)的ELISA技术。提取并纯化类风湿关节炎(RA)患者血清中的ACPA-IC,并对ACPA-IC中的抗原进行鉴定。研究ACPA-IC对RA患者成纤维样滑膜细胞(FLS)功能的影响。
   方法:⑴建立检测人血清ACPA-IC的ELISA技术。收集RA、SLE患者以及健康人血清,用PEG6000沉淀法提取血清中IC,检测IC中的ACPA-IC水平,并与年龄、ACPA、类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)、抗“O”、血沉(ESR)、IgG、IgA、IgM、补体C3、补体C4等参数进行相关性分析。⑵采用G蛋白免疫亲和层析法,纯化RA患者血清中的IC,Western-blotting检测IC中四种自身抗原。⑶收集手术切除的RA患者关节滑膜组织,应用胶原酶法消化提取滑膜组织细胞,体外培养成纤维样滑膜细胞(FLS)。⑷用纯化的IC刺激FLS,采用CCK-8方法检测刺激后FLS的增殖情况,ELISA检测培养上清中FLS分泌的IL-8含量。
   结果:①成功建立检测血清ACPA-IC水平的ELISA技术。ACPA阳性RA患者血清中ACPA-IC水平明显高于ACPA阴性RA患者ACPA-IC,RA患者血清ACPA-IC水平显著高于SLE患者和正常对照,并与ACPA浓度、RF和ESR呈正相关性,其r值分别为0.978、0.471和0.44,P值均小于0.05。而与年龄、CRP、抗“O”、IgG、lea、IgM、补体C3、补体C4等参数无相关性。②通过G蛋白免疫层析法从RA血清中提取IC,SDS-PAGE鉴定IC的结果表明,用G蛋白柱免疫亲和层析法从血清中可纯化出纯度较高的抗原抗体IC。Western-blotting结果显示,ACPA+RA患者血清IC含有含有较高水平的GRP75抗原,Grp75主要定位在FLSs胞浆中。③CCK-8细胞增殖试验结果表明,RA患者血清ACPA—IC可以明显促进FLS增殖;并可刺激FLS分泌大量IL-8(P≤0.05)。
   结论:⑴成功建立检测特异性ACPA-IC的ELISA技术,RA患者血清ACPA-IC水平显著高于SLE患者和正常对照,并与ACPA、RF和ESR含量具有相关性。⑵ACPA-IC阳性RA患者血清IC中含有特异性ACPA-Grp75复合物。⑶RA血清ACPA-IC能够促进FLS生长及分泌IL-8。

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