ASKI巯其亚硝基化对ASKI激酶活性调节机制的研究和PYK2亚硝基化的初步鉴定

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目的:一氧化氮(NO)是一种易扩散的较小的生物活性分子,参与了众多的生理和病理过程。其可以直接与蛋白质自巯基反应发生亚硝基化。凋亡信号调节激酶1(ASK1)是一种调节细胞凋亡的广泛存在的因子。前期试验证明,ASK1在脑缺血/再灌注中可能由于亚硝基化激活,但是具体机制尚未明确。本文研究目的在于在HEK293细胞中研究ASK1亚硝基化及对其活性的影响。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)是粘着斑激酶家族的成员之一,在脑缺血/再灌注后激活并引起细胞凋亡。为此本文探讨了PYK2的亚硝基化及在脑缺血/再灌注中的改变。
　　方法:采用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型,观察PYK2在脑缺血/再灌注后的磷酸化和亚硝基化改变。利用脂质体和磷酸钙转染技术高效转染HEK293细胞。转染后的细胞用外源性NO供体刺激或共转染的细胞用A23187刺激,生物素转化法检测过表达目的蛋白的亚硝基化程度。利用还原性/非还原性电泳鉴定ASK1二聚体。原代海马细胞体外培养进行缺糖缺氧/再灌注,施加NMDA受体拮抗剂MK801和nNOS抑制剂7NI,通过DAPI染色检测神经元凋亡。
　　结果:过表达的HEK293细胞给予GSNO处理可以使ASK1和PYK2发生亚硝基化,而GSNO降解产物不能使ASK1和PYK2亚硝基化。DTT,NEM可以在HEK293细胞中阻止由GSNO引起的ASK1和PYK2的亚硝基化。GSNO处理可以引起ASK1二聚化和Thr845磷酸化的升高,Cys869被鉴定为ASK1亚硝基化位点,将其突变为丙氨酸后,GSNO处理不能使ASK1亚硝基化同时也不能升高ASK1的磷酸化水平。MK801,7NI可以降低OGD引起的神经元损伤。在脑缺血/再灌注中PYK2发生亚硝基化,并伴随着Tyr402磷酸化的升高。
　　结论:内源性与外源性NO均可使ASK1发生亚硝基。ASK1的亚硝基化可以通过增加其二聚体而升高Thr845的磷酸化水平从而激活ASK1。PYK2在HEK293细胞中可以与外源性和内源性NO反应发生亚硝基化,并初步证明在脑缺血/再灌注中PYK2发生亚硝基化并有可能增加了PYK2的活性。

著录项

作者
刘东海;
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作者单位

徐州医科大学;

徐州医学院;

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授予单位徐州医科大学;徐州医学院;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名张光毅;
年度 2010
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类急性脑血管疾病（中风）;
关键词
巯基亚硝基化; 脑缺血; 一氧化氮; 生物活性;

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