大肠杆菌噬菌体宿主特异性形成的尾丝蛋白分子基础

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致病性大肠杆菌导致大肠杆菌病，在养殖业产生了重大的经济损失。目前，通常使用抗生素来治疗大肠杆菌病，然而临床中抗生素的不规范使用导致了抗生素耐药性的产生。人们重新考虑利用噬菌体作为替代制剂，应用于控制畜禽的大肠杆菌感染。噬菌体作为抗菌制剂面临的主要缺点是宿主谱窄及难以快速筛选出针对特异病原菌的噬菌体。在噬菌体T4及T7中，尾丝蛋白是决定噬菌体宿主谱特异性的关键区域。本研究从分离到的T4-like烈性噬菌体及P2-like温和噬菌体两个方面出发，针对尾丝蛋白进行受体识别特异性区域的研究。我们建立了可进行大肠杆菌烈性噬菌体及温和噬菌体基因操作的改造平台，定位出了T4-like烈性噬菌体WG01及P2-like温和噬菌体P88的宿主谱特异性决定区域，对两种噬菌体的尾丝蛋白进行替换后，两种噬菌体均可以改变或拓宽宿主谱。另外，采用动物实验评估了噬菌体鸡尾酒疗法对细菌感染的治疗作用。本研究可以为噬菌体临床应用提供一定的理论基础。 1大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及基因组测序噬菌体毒株是进行噬菌体功能研究及治疗实验的基础。本研究进行了大肠杆菌烈性噬菌体和温和噬菌体的分离鉴定、生物学特性分析及全基因组测序。烈性噬菌体分离自鸡粪及鸭粪样品。温和噬菌体分离自实验室54株已证明存在前噬菌体的大肠杆菌菌株。共分离到200余株噬菌体，对其中40余株进行了电镜观察，并对8株噬菌体进行了全基因组测序。测序的8株噬菌体中，6株噬菌体为烈性噬菌体，2株噬菌体为温和噬菌体。烈性噬菌体为T7-like噬菌体P483和P694;C3-like噬菌体172-1;T4-like噬菌体QL01、WG01和MX01。温和噬菌体为P2-like噬菌体P88和pro147。本研究中测序的基因组数据为噬菌体基因组数据库提供了新的数据资料，为后续研究提供了充足的实验材料。 2两株T7-like禽致病性大肠杆菌噬菌体的比较基因组及功能分析噬菌体P483和P694为首次分离自禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic E.coli，APEC)的T7-like噬菌体。P483和P694的比较基因组学分析显示两株噬菌体中的大部分蛋白和肠杆菌科噬菌体BA14和285P，欧文氏菌属噬菌体FE44，克吕沃尔氏菌属噬菌体Kvp1相比，都具有很高的序列相似性(＞85％)。但是，一些蛋白如gp0.6a、gp1.7和gp17与其他T7类噬菌体相比，显示了较低的同源性(＜85％)。噬菌体P694的gp0.3、gp1.1和gp1.2都具有两种类型的编码基因，这两种类型的编码基因之间相似性很低。gp0.3可以阻止噬菌体基因组被宿主菌降解。Gp1.2和dGTPase形成紧密的复合体并阻止宿主菌的活性。上述分析说明P694进化出了一种躲避细菌抵抗的策略。本研究加深了我们对T7-like噬菌体进化的理解，同时这两株噬菌体可以作为临床治疗制剂的候选噬菌体株。 3P2-like噬菌体改造实验及受体识别位点鉴定噬菌体作为治疗制剂主要受限于宿主谱窄及宿主特异性强，及对受体识别分子基础研究的缺乏。本实验中，两株P2-like肠杆菌科噬菌体P88和pro147，分别诱导自大肠杆菌K88和DE147。将这两株P2-like肠杆菌科噬菌体P88和pro147与GenBank数据库中的P2-like肠杆菌科噬菌体进行比较，发现在大多数肌尾噬菌体中决定受体识别的关键基因尾丝蛋白序列比其他保守基因裂解酶、复制酶及末端酶序列具有更高的变异度。实验首先将P88尾丝蛋白高变区(HR1:氨基酸576-695;HR2:氨基酸716-746)替换为pro147对应部分，结果HR2片段替换后，P88宿主谱发生了变化。然后将P88尾丝蛋白高变区HR2中的6个氨基酸位点替换为pro147对应氨基酸位点。氨基酸730（亮氨酸）和744（谷氨酸）位点替换后宿主谱发生了变化，说明这两个氨基酸位点对于P88宿主谱形成发挥了重要作用。本研究建立了温和噬菌体改造平台，溶源菌可作为载体对其中的噬菌体基因进行改造，达到改变或拓宽宿主谱的目的。本研究结果显示，P2-like噬菌体P88的尾丝蛋白决定了受体识别特异性，氨基酸716-746为关键区域，氨基酸位点730和744为关键氨基酸位点。 4T4-like噬菌体gp37的改变可以拓宽宿主谱噬菌体作为治疗制剂主要受限于其宿主谱窄及难以快速筛选出针对特定病原菌的噬菌体。本研究的目的是首先通过将宽谱T4-like噬菌体QL01的宿主谱决定基因替换给窄谱T4-like噬菌体WG01，使窄谱噬菌体WG01获得宽谱噬菌体QL01的宿主谱范围，然后找出决定受体识别的关键区域，利用同源序列库来替换关键区域达到拓宽宿主谱的目的。实验结果显示，第一步替换过程直接引发了WG01宿主谱的扩宽。WG01的后代不但获得了QL01和WG01的宿主谱，还可以感染另外8株细菌。WQD1具有最宽的宿主谱，提示其对应的片段QD可以用来建立一个同源序列库。通过对gene37进行基因组测序分析，我们发现WG01可以通过两种方式拓宽宿主谱:①第一代形成的嵌合体本身;②嵌合体产生的第二代突变体。宿主谱发生了拓宽表明:除了已报道的C端决定了受体结合特异性，其他区域可能通过改变支撑作用间接影响了受体结合特异性。另外，我们也发现了噬菌体的另一种宿主谱拓宽方式:WG01噬菌体通过替换尾丝蛋白基因，具有了更宽温度范围的裂解能力。本实验提供了一种可以快速改变或拓宽噬菌体宿主谱的方法。随着噬菌体筛选库中噬菌体数量的增加及研究的不断深入，临床中快速筛选针对特定病原菌的噬菌体将会成为可能。 5噬菌体鸡尾酒疗法治疗禽致病性大肠杆菌病细菌耐药性的不断增加使人们重新考虑使用噬菌体来控制细菌感染。为了探讨噬菌体鸡尾酒疗法对禽致病性大肠杆菌感染的治疗效果，选择三种不同的T4-like噬菌体制成鸡尾酒制剂，对DE205B人工感染鸭进行保护效率评价。采用肌肉注射、口服和滴鼻三种不同的方式进行给药。结果表明，肌肉注射治疗组(存活率100％)比口服治疗组（存活率28.7％）和滴鼻治疗组（存活率0％）有更显著的治疗效果。另外，对口服治疗组中34到60小时之间不同时间点死亡的雏鸭进行噬菌体分离，只有噬菌体PH1可从死亡雏鸭心脏、肝和肺中分离到。重新分离的噬菌体的数量在心脏中达到3.07×107-1.07×109PFU/g，在肝脏中达到2.16×105-4.33×107PFU/g，在肺中达到9.92×104-1.69×108PFU/g。这些噬菌体在体内可达到较高的浓度，并可明显减少细菌的数量。在三种不同的给药方式中，肌肉注射是最佳方法，治疗后存活率达到100％。在本研究所使用的三种噬菌体中，噬菌体PH1具有转移能力，可从胃肠道进入心血管系统。当面对禽致病性大肠杆菌感染时，噬菌体鸡尾酒制剂肌肉注射是一个可选的治疗方案。随着对噬菌体的转移能力机制的进一步了解，噬菌体口服治疗可作为一个可选的预防方案。

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作者
陈绵绵;
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作者单位

南京农业大学;

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授予单位南京农业大学;
学科兽医学；预防兽医学
授予学位博士
导师姓名张炜;
年度 2017
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类饲料作物、牧草;病虫害及其防治;
关键词
大肠杆菌噬菌体; 宿主特异性; 丝蛋白;

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