石榴皮多酚及其酶解产物的抗氧化活性和对氧化应激小鼠的保护作用研究

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本文在研究了石榴皮多酚中三种分子量不同的代表性化合物的体内外抗氧化活性基础上，建立了单宁酶水解石榴皮多酚的最佳反应条件与纯化工艺;针对酶解前后多酚，进行了化合物成分鉴定和体外活性比较，研究了其体内吸收转化与抗氧化作用，并考察探讨了其对氧化应激模型动物的氧化损伤修复作用及相关机制。主要研究内容包括以下五个试验: 1.石榴皮中分子量不同的三种代表性多酚化合物体内外抗氧化活性研究本试验旨在通过比较石榴皮中分子量不同的三种代表性多酚化合物——大分子安石榴苷及其不完全水解产物安石榴林和完全水解产物鞣花酸的体内外抗氧化作用，为石榴皮多酚降解的必要性提供初步依据。首先我们以水溶性维生素E为参照，测定了安石榴苷、安石榴林、鞣花酸的体外抗氧化作用，包括DPPH·清除能力、超氧阴离子(O2·-)清除能力、铁离子还原能力（FRAP）以及在亚油酸体系中抑制脂质过氧化(LPO)能力。这部分结果显示，清除DPPH·能力为鞣花酸＞安石榴苷＞安石榴林＞水溶性维生素E，清除O2·-能力为安石榴苷＞安石榴林＞鞣花酸≈水溶性维生素E，FRAP为鞣花酸＞安石榴苷≈安石榴林＞水溶性维生素E，LPO抑制能力为水溶性维生素E＞安石榴苷＞鞣花酸＞安石榴林。然后我们用氧化鱼油诱导小鼠产生氧化应激损伤，考察了口服10mg/kg bw三种多酚化合物21天对氧化应激小鼠生长性能、血清、肝脏和空肠氧化还原指标、空肠黏膜组织形态及空肠炎症相关因子mRNA表达的影响。这部分结果显示，鞣花酸使氧化应激小鼠日增重、血浆、肝脏及肠道T-AOC、肠道SOD和GSH-Px活性、肝脏SOD活性，小肠绒毛高度与隐窝深度比等显著提高（P＜0.05），血浆、肝脏及肠道MDA含量、肠道炎症因子(TNF-α、IL-6及IFN-γ)基因表达水平显著下降(P＜0.05);口服安石榴林显著降低空肠组织MDA含量及TNF-α和IL-6基因表达水平(P＜0.05)，显著提高肠道SOD和GSH-Px活性(P＜0.05);口服安石榴苷显著降低肠道MDA含量及TNF-α基因表达水平(P＜0.05)，显著提高肠道SOD和GSH-Px活性(P＜0.05)。结论:安石榴苷、安石榴林、鞣花酸三种多酚都具有很强的体外抗氧化作用，并且对不同自由基的清除能力不同;三种多酚中分子量最小的鞣花酸对小鼠的氧化应激损伤的修复和保护作用最显著，这为对石榴皮多酚进行酶解的必要性提供了依据。 2.石榴皮多酚的酶解与纯化工艺研究本试验旨在通过单宁酶对石榴皮多酚的降解，降低安石榴苷等大分子多酚的含量，提高鞣花酸等小分子多酚的含量，并同时确立酶解的最佳条件和纯化的工艺参数。本试验利用单宁酶水解石榴皮多酚，采用高效液相色谱(HPLC)技术确定以安石榴苷降解率和鞣花酸生成率为酶解程度检测指标，通过单因素试验设计和正交试验设计优化酶解反应条件，通过静态吸附和动态吸附试验确定了大孔树脂纯化工艺。结果显示:酶解反应最佳条件为pH5.2、45℃、加酶量为30mL/g底物、反应时间16h。确定使用D101型大孔树脂对酶解反应液进行纯化，95％乙醇为洗脱剂，当使用ψ2.0cm×30.0cm玻璃层析柱进行动态吸附时，动态上样体积为300mL、洗脱积为120mL。在最佳大孔树脂纯化条件下纯化获得原石榴皮多酚，得率为71.39％，其总多酚含量为81.50％，安石榴苷含量为43.64％，鞣花酸含量为4.85％。在最佳酶解条件及最佳大孔树脂纯化条件下获得石榴皮多酚酶解产物，得率为54.09％，其总多酚含量为80.40％，安石榴苷含量为0.00％，鞣花酸含量为45.73％。本试验获得酶解工艺和大孔树脂纯化的最优条件，为酶解多酚的制备提供基础数据。 3.石榴皮多酚及其酶解产物的成分分析与体外活性研究本试验旨在比较石榴皮多酚及其酶解产物在化合物成分、清除自由基能力、沉淀蛋白质和金属离子能力上的差异，为其体内活性的差异提供机理解释。以原石榴皮多酚及其酶解产物为研究对象，利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行成分分析，比较酶解前后的体外抗氧化活性（水溶性维生素E做参照）及与蛋白质、金属离子形成沉淀能力。LC-MS/MS分析结果显示原石榴皮多酚中鉴定出7个化合物峰。多酚酶解产物中鉴定出4个化合物峰。体外抗氧化试验显示原石榴皮多酚的DPPH.清除能力、O2·-清除能力以及FRAP均优于水溶性维生素E，在亚油酸体系中LPO抑制能力低于水溶性维生素E;酶解产物的DPPH·清除能力与水溶性维生素E接近，O2·-请除能力在低浓度下略低于水溶性维生素E、高浓度下略高于水溶性维生素E，FRAP介于原石榴皮多酚和水溶性维生素E之间，脂质过氧化抑制能力低于水溶性维生素E。在pH2和pH7条件下，酶解产物与牛血清白蛋白以及Cu2+、Zn2+金属离子形成沉淀的能力均低于原石榴皮多酚。结论:石榴皮多酚经酶解后多酚化合物种类减少、分子量减小、大分子多酚消失，说明通过酶解作用使多种大分子多酚降解为小分子多酚。酶解后的石榴皮多酚体外抗氧化活性有所下降，但仍然与抗氧化剂水溶性维生素E相当。酶解后石榴皮多酚与原多酚相比抗营养作用减小。 4.石榴皮多酚及其酶解产物在小鼠血液中的代谢产物鉴定及对正常小鼠生长和氧化还原状态的影响本试验旨在研究石榴皮多酚及其酶解产物在正常小鼠体内的代谢产物和对正常小鼠氧化还原状态及抗氧化信号通路基因表达的影响。小鼠口服400mg/kg bw的石榴皮多酚及其酶解产物后，利用LC-MS/MS检测技术，对其血液中代谢物进行鉴定。结果显示，在口服多酚0.5h后的血液中发现代谢产物，原多酚代谢产物有2种，一种为尿石素A硫酸盐，另一种为硫酸邻/间尉甲酚;酶解多酚代谢产物有3种，分别为4-乙烯基苯酚硫酸盐、硫酸邻/间/对甲酚、葡萄糖邻/间/对甲酚。36只小鼠平均分为3组，分别为对照组（口服溶剂）、原石榴皮多酚组（口服10mg/kg bw原石榴皮多酚）、酶解多酚组（口服10mg/kg bw酶解多酚），试验期28天。结果显示酶解多酚显著降低血浆和肝脏中蛋白质羰基碳含量(P＜0.05)、提高肝脏GSH水平(P＜0.05)，口服原多酚仅降低肝脏蛋白质羰基碳含量(P＜0.05);口服原多酚和酶解后多酚均显著提高肝脏Keap1、Nfe212、Hmox1、Nqo1和Gclc基因表达水平（P＜0.05），且酶解后多酚组显著高于原多酚组（P＜0.05）;其它指标均无显著变化(P＞0.05)。这说明酶解多酚在体内的吸收转化和代谢产物与原多酚不同，原多酚代谢产物主要是微生物代谢产物转化而来，酶解后多酚血液代谢产物的母体分子更小，直接被机体吸收转化的可能性增大。酶解多酚在体内的抗氧化作用更强，上调Keap1-Nrf2抗氧化通路相关基因mRNA表达的能力也更强。 5.石榴皮多酚及其酶解产物对氧化应激小鼠氧化损伤的修复作用研究本试验旨在研究石榴皮多酚及其酶解产物对小鼠氧化损伤的修复作用。72只小鼠平均分为8组，其中1组饲喂含5％新鲜鱼油的饲料（FFO组），1组饲喂含5％氧化鱼油的饲料（OFO组），其余6组在饲喂氧化鱼油基础上分别每日口服10、30、50mg/kg bw的石榴皮多酚(PP)或其酶解产物(EP)，试验期10天。结果显示:与FFO组相比，OFO组的日增重显著下降(P＜0.05)，血浆过氧化产物MDA和一氧化氮(NO)含量显著增加(P＜0.05)，十二指肠胰蛋白酶和脂肪酶活力显著降低（P＜0.05），空肠绒毛形态破坏明显，抗氧化通路基因（Keap1,Nfe212、Gclc和Hmox1）表达水平显著升高(P＜0.05)，抗氧化酶Nqo1基因表达下降(P＜0.05)，多种损伤修复因子（Cldn1、Ocln,Ogg1、Tfam,Tjp1）基因表达水平显著下降(P＜0.05)。与OFO组相比，口服10mg/kg bw剂量的PP和EP均显著提高ADG（P＜0.05），并达到与FFO组无差异水平(P＞0.05)，显著增加空肠上皮抗氧化通路基因(Nfe212、Nqo1、Gclc和Hmox1)及损伤修复因子（Cldn1、Ocln和Tfam）基因表达水平(P＜0.05);OFO+PP的50mg/kg bw剂量组血浆NO显著降低(P＜0.05)，OFO+EP的30和50mg/kg bw剂量组血浆NO含量均显著降低(P＜0.05)，30mg/kg bw剂量组血浆MDA含量显著降低（P＜0.05）;OFO+PP的50mg/kg bw剂量组十二指肠淀粉酶活性显著降低(P＜0.05)，其它均无显著影响(P＞0.05);OFO+PP的10和50mg/kg bw剂量组、OFO+EP的10,30,50mg/kg bw剂量组空肠上皮淋巴细胞阳性率显著降低(P＜0.05)，OFO+EP的50mg/kg bw剂量组空肠上皮杯状细胞阳性率显著增加(P＜0.05)。结论:酶解后多酚在降低血液多种过氧化物水平、改善空肠上皮分泌功能、上调肠道抗氧化通路和黏膜损伤修复基因表达方面优于原多酚，且对消化酶活性没有显著抑制作用。综上所述，该研究考察了石榴皮多酚中结构单元相似、分子量不同的代表性化合物的体内外抗氧化活性，提出小分子多酚活性体内抗氧化活性更强的观点，在此基础上对石榴皮多酚进行了单宁酶降解，并优化了酶解和产物纯化工艺条件，获得了以鞣花酸为主的小分子多酚酶解产物，该酶解产物抗营养作用降低，体外清除自由基能力有所降低，体内抗氧化及肠道损伤修复活性增强。该研究为新型的抗氧化应激饲料添加剂的开发提供新思路。

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作者
孙雨晴;
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作者单位

南京农业大学;

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授予单位南京农业大学;
学科畜牧学；动物营养与饲料科学
授予学位博士
导师姓名徐子伟,王恬;
年度 2016
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正文语种中文
中图分类药理学;
关键词
石榴皮; 多酚; 酶解产物; 抗氧化活性; 氧化应激; 小鼠;

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