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农杆菌介导大豆子叶节转化体系的优化及大豆耐铝毒候选基因GmSTOP1的克隆与功能分析

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摘要

第一章 文献综述

1 大豆遗传转化的研究进展

1．1 大豆再生体系的研究进展

1．2 大豆遗传转化方法的研究进展

1．3 影响农杆菌介导法转化的主要因素

1．4 大豆遗传转化的展望

2 植物耐铝毒的相关研究进展

2．1 我国土壤铝毒现状

2．2 铝毒对植物的危害

2．3 植物耐铝毒机制

3 STOP1锌指蛋白转录因子的研究进展

3．1 植物C2H2锌指蛋白的结构和功能

3．2 STOP1转录因子的研究进展

4 本研究目的及意义

5 技术路线

第二章 大豆遗传转化体系的研究

1 材料与试剂

1．1 试验材料

1．2 供试载体及菌株

1．3 供试试剂及主要仪器

1．4 培养基

2 实验方法与试验设计

2．1 大豆的遗传转化步骤

2．2 相关影响因素试验设计

3 结果与分析

3．1 菌液浓度对侵染效率的影晌

3．2 发芽方式比较试验

3．3 重悬液CCM中DTT对侵染效率的影响

3．4 共培养时间比较试验

3．5 不同GA3和IAA激素浓度对不定芽伸长的影响

4 讨论

4．1 农杆菌浓度与侵染效率的关系

4．2 外植体制备方式的选择

4．3 抗氧化剂DTT与侵染效率的关系

4．4 共培养时间与侵染效率的关系

4．5 GA3及IAA与不定芽伸长的关系

第三章 大豆耐铝毒候选基因GmSTOP1的克隆与功能分析

1 实验材料

1．1 植物材料

1．2 菌株及质粒

1．3 试剂及酶类

1．4 主要仪器

2 实验方法

2．1 胁迫处理及取样

2．2 总RNA提取与检测

2．3 cDNA的合成

2．4 大豆GmSTOP1基因的克隆

2．5 GmSTOP生物信息学分析

2．6 GmSTOP1蛋白的亚细胞定位

2．7 GmSTOP1的荧光定量PCR表达分析

2．8 植物表达载体的构建

2．9 转化农杆菌EHA105

2．10 拟南芥转化

2．11 转基因植株的筛选和鉴定

2．12 转GmSTOP1拟南芥的功能研究

3 结果与分析

3．1 大豆GmSTOP1基因的克隆

3．2 GmSTOP1编码蛋白的亚细胞定位

3．3 GmSTOP1在不同组织中的荧光定量PCR分析

3．4 GmSTOP1在AlCl3、ABA、NaCl和PEG胁迫处理下的荧光定量分析

3．5 GmSTOP1表达载体的构建

3．6 GmSTOP1基因功能的研究

4 讨论

结论

本研究创新之处

参考文献

附录

致谢

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摘要

大豆作为优质植物蛋白食品和植物油的重要来源，一直是世界各国不容忽视的作物之一。近年来随着我国人民生活水平的提高，国内大豆供求矛盾也越来越严重，传统的大豆生产技术已经不能满足国内市场的需求。通过生物技术可培育出抗虫、抗除草剂、优质等大豆品种，更易于耕作管理。但目前大豆转基因技术体系依然存在转化效率低、稳定性差、理想受体基因型少、实验室间重复性较差等突出问题，与水稻等作物相比，在转化效率和规模化水平上均存在很大差距。只有建立了稳定的再生体系，结合高效率的转化方法，才有可能使转基因技术更好地为大豆遗传育种服务。
　　本研究对农杆菌介导的大豆子叶节转化体系的农杆菌浓度、发芽方式、重悬培养基、共培养天数、芽伸长阶段的激素浓度等几个影响因素进行了优化，提高了农杆菌的侵染效率和芽伸长率，建立了一种转化效率较高、稳定性好的大豆转化技术体系。主要结果如下:
　　(1)农杆菌的浓度是影响侵染效率的重要因素。试验发现分别用OD650值为0.6、0.8和1.0等3个菌液浓度侵染大豆品种Jack紫子叶节时，GUS瞬时表达率分别为97.0％、90.7％和85.6％，其中OD650为0.6时对大豆子叶节的侵染能力显著高于0.8和1.0(shortest significant ranges，SSR测验P＜0.05)，天隆一号的试验结果与Jack紫的一致。所以，OD650为0.6是比较适用于大豆子叶节转化的农杆菌的浓度。
　　(2)不同发芽方法制备的子叶节外植体存在较大的侵染效率差异。在Jack紫和天隆一号中选取吸胀1d、萌发1d、萌发3d、萌发5d等4种发芽方式制备子叶节外植体，试验发现吸胀1d的子叶节外植体GUS总瞬时表达率最高，Jack紫和天隆一号分别达到76.3％和96.7％，显著（SSR测验P＜0.05）高于其他3种萌发方式，是最佳的发芽方式。
　　(3)低浓度的抗氧化剂能够阻止细胞的坏死，提高农杆菌的侵染效率。本试验发现以Jack紫和天隆一号为试验品种在重悬培养基CCM中添加DTT后GUS染色深瞬时表达率比对照组分别提高16％和35％，GUS总瞬时表达率也分别提高了13％和3％，说明DTT的添加有利于提高农杆菌的侵染率。
　　(4)在相同的培养条件下，农杆菌侵染效率在3d、4d、5d、6d等4个不同共培养天数之间没有显著差异，因此认为共培养天数可以选择3d。
　　(5) GA3和IAA在对茎芽伸长生长的作用上存在协同关系，在芽伸长阶段加入不同浓度的GA3和IAA后发现1.0 mg·L-1 GA3和0.1 mg·L-1IAA这一组合的不定芽伸长率最高，可以达到12.2％，显著（SSR测验P＜0.05）高于其他三种浓度组合，比实验室原有的浓度组合(0.5 mg·L-1 GA3和0.1 mg·L-1IAA)提高了8.5％，可有效提高不定芽伸长率。
　　我国南方地区广泛分布着各种红色或黄色的酸性土壤，总面积达2亿hm2，占全国土地总面积的22.7％，占全国耕地面积的28％。酸性土壤中的铝毒害是农业生产中作物生长和产量的主要限制因素之一，更是影响我国南方地区大豆产量的最重要因素。因此，在中和土壤酸度的同时，挖掘大豆自身的耐铝毒潜力和耐铝毒基因，获得耐铝毒能力强的大豆品种是解决酸性土壤中铝毒害最持之有效的方法。
　　拟南芥中的AtSTOP1(Arabidopsis thaliana sensitive to proton rhizotoxicity1)是一个调控多种铝毒耐受机制相关基因表达的转录因子，在拟南芥耐铝毒中发挥重要作用。为研究大豆中STOP1-like基因的表达特性，本研究利用RT-PCR从耐铝毒大豆品种科丰1号中克隆了一个位于16号染色体的STOP1-like基因，命名为GmSTOP1。该基因的编码区(coding DNA sequence，CDS)序列长度为1566 bp，编码521个氨基酸。在GmSTOP1起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到多种顺式作用元件，包括与激素、热、逆境响应等相关的应答元件，如ABRE、HSE、TC-rich重复序列等。蛋白质结构预测表明GmSTOP1不具有跨膜结构和信号肽，含有4个保守的Cys-2-His-2锌指蛋白结构域。系统进化分析显示GmSTOP1与菜豆(Phaseolus vulgaris)中的STOP1-like蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示GmSTOP1定位于细胞核，说明GmSTOP1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。GmSTOP1基因在种子中的相对表达量最高，在根、茎尖分生组织、茎、叶、花、荚等多种组织中也均有表达。用25μmol L-1AlCl3溶液处理大豆幼苗，GmSTOP1基因在根中上调表达，24 h达到最高相对表达量，约为对照(0μmol·L-1AlCl3)的9.2倍，表明该基因的表达受铝离子的诱导。此外，ABA、NaCl和PEG等胁迫也能诱导大豆根和叶中GmSTOP1基因的上调表达。
　　用15μmol·L-1AlCl3(pH4.3)处理GmSTOP1过表达的拟南芥植株，转基因株系根长显著（SSR测验P＜0.05）大于野生型。两个转基因株系的相对根生长量AlCl3/pH5.8及pH4.3/pH5.8与野生型之间也都存在显著（SSR测验P＜0.05）差异。不同浓度的NaCl（50、100、150 mmol·L-1）和甘露醇(100、200、300 mmol·L-1)分别处理GmSTOP1过表达的拟南芥植株，10d后野生型和过表达株系的主根生长都受到一定程度的抑制，但过表达株系的主根长显著（SSR测验P＜0.05）大于野生型的根长。在最高浓度的NaCl和甘露醇处理下野生型拟南芥平均根长只分别有3.8mm和9.3 mm，转基因株系根长可达到6.6 mm和14mm以上。结合real-time PCR结果，我们推测GmSTOP1基因的过量表达能够在一定程度上提高植物对铝毒、高盐和渗透胁迫的抗性。

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