疫霉菌一个新病原相关模式分子PsXEG1的鉴定和功能分析

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大豆疫霉是引起大豆根腐病并能快速扩展造成大豆毁灭性病害的一种病原菌。它不仅在中国甚至在全世界范围内严重威胁着大豆的生产安全。大豆疫霉隶属于卵菌，在形态上，大豆疫霉虽然同真菌相似，但在进化上却和硅藻及蓝藻关系较近，所以针对于真菌设计的杀菌剂往往对大豆疫霉无效;同时农业生产中无毒基因进化速度之快使得抗病育种难以长时间发挥作用。防治大豆疫霉引起的病害是大豆生产中的重要难题，开发高效持久的抗卵菌病害策略是关乎农业生产，国民经济发展，甚至国家命运的大事。
　　植物与病原菌互作过程中，植物通过先天免疫系统能够识别病原菌的病原相关模式分子（pathogen/microbe-associated molecular patterns，PAMP），触发自身的免疫反应（PAMP-triggered immunity，PTI），从而抵抗大部分病原菌的侵染。病原相关模式分子是在一系列微生物中广泛存在，且对微生物的适应和生存起着重要作用的一类非常保守的物质。在卵菌中，目前鉴定到的病原相关模式分子有β-葡聚糖(β-glucans)、七葡萄糖糖苷(heptaglucoside)、谷氨酰胺转移酶（transglutaminase，Pep13）、结合纤维素的激发子凝集素(cellulose-binding elicitor lectins，CBDs)、激发素(elicitins)和坏死诱导蛋白(NLP)。但是，植物如何识别卵菌的病原相关模式分子来抵抗卵菌侵染还有待进一步研究。在卵菌中鉴定新的病原相关模式分子，并探究其触发植物免疫的机制，将在理论上有助于理解植物的抗病机制，实践上有助于抗病品种的开发和利用。因此，本文对大豆疫霉的病原相关模式分子进行了系统的挖掘，并对鉴定到的一个新的病原相关模式分子PsXEG1在植物与病原物互作过程中的功能及其可能的机制进行了分析，获得的主要结果和结论如下:
　　大豆疫霉糖基水解酶GH12(Glycoside Hydrolase12)蛋白PsXEG1是一个新的病原相关模式分子。本文通过液相色谱在大豆疫霉的培养液中纯化到能在本氏烟上诱发细胞死亡的蛋白。通过对该蛋白进行质谱测序，鉴定到几个诱发细胞死亡的候选蛋白。通过蛋白注射以及农杆菌介导的瞬时转化方法在本氏烟中表达这些候选蛋白，发现Ps109681(PsXEG1)能在本氏烟中触发细胞死亡，而且PsXEG1是未被报道过的蛋白，表明PsXEG1是一个新的激发子。PsXEG1还能在番茄、辣椒和大豆中诱发植物的细胞死亡，表明PsXEG1在不同植物上具有激发活性的广谱性。PsXEG1的信号肽缺失突变体不能在本氏烟中诱发细胞死亡，说明信号肽对PsXEG1发挥其激发子活性是必需的，这表明PsXEG1作用于植物质外体触发植物的细胞死亡。酶活性测定实验显示，PsXEG1具有木葡聚糖酶水解活性，而PsXEG1丧失酶活性的突变体仍然能在本氏烟上触发细胞死亡，表明PsXEG1诱发植物细胞死亡的能力不依赖于其水解酶活性。PsXEG1不能在沉默NbSerk3/Bak1的本氏烟上诱发细胞死亡，表明PsXEG1诱发植物细胞死亡的能力依赖于NbSerk3/Bak1受体蛋白的识别。PsXEG1能够在沉默LeEIX2的番茄上诱发细胞死亡，说明PsXEG1诱发的细胞死亡不依赖于LeEIX2的识别作用，这进一步表明PsXEG1是一个不同于EIX(Ethylene-inducing xylanase)的一类新的激发子。PsXEG1蛋白处理本氏烟能抑制辣椒疫霉侵染表明植物识别PsXEG1能触发植物的免疫。PsXEG1同源蛋白在卵菌、真菌和细菌中广泛存在，并且其激发子活性在卵菌和真菌中广泛存在，表明PsXEG1代表的糖基水解酶GH12蛋白是一类新的病原相关模式分子。
　　植物通过识别PsXEG1蛋白的N端PsXEG120-53(PXN1)触发免疫反应。本文对PsXEG1在卵菌、真菌和细菌中的同源蛋白序列进行比对分析，发现PsXEG1这类蛋白中存在三个保守区段:PsXEG120-53、PsXEG1211-241和PsXEG1117-159。其中PsXEG120-53是位于N端的保守区段，PsXEG1211-241和PsXEG1117-159分别是包含保守酶活位点的区段。PsXEG1蛋白的删除突变体实验显示，PsXEG1诱发植物细胞死亡的能力依赖于蛋白的完整性，而对于蛋白的不同区段而言，PsXEG1蛋白的N端对其诱发过敏反应的能力起决定性作用。体外合成PsXEG120-53、PsXEG1211-241和PsXEG1117-159三个肽段试验显示，PXN1(PsXEG120-53)能诱发植物活性氧的积累、防卫基因的表达和本氏烟对烟草疫霉菌的抗性。不能在本氏烟上诱发细胞死亡的PsXEG1同源蛋白，其N端替换成PXN1后具备了诱发细胞死亡的能力，表明PXN1是植物识别PsXEG1蛋白的关键区域。PsXEG1蛋白N端氨基酸位点突变试验以及PsXEG1蛋白突变体的三维结构分析显示，PsXEG1蛋白N端的芳香族氨基酸和亲水性氨基酸对PsXEG1诱发的过敏反应起决定性作用，进一步表明这些氨基酸可能是植物识别PsXEG1的潜在位点。
　　PsXEG1在大豆疫霉侵染大豆过程中的双重功能:致病毒力因子和病原物相关模式分子。植物病原菌的水解酶通常可以降解植物的大分子物质提供自身需要的营养，或者产生一些有毒的次生代谢产物，这些过程都可以帮助病原菌进行侵染。为了确定PsXEG1在大豆疫霉侵染过程中的作用，本文对PsXEG1在大豆疫霉菌丝、游动孢子、休止孢、萌发的休止孢和12个不同侵染时间点的转录水平进行分析。结果显示，PsXEG1在大豆疫霉侵染大豆黄化苗初期明显上调表达，表明PsXEG1可能参与了大豆疫霉侵染初期的致病过程。大豆疫霉中沉默和过表达PsXEG1均降低大豆疫霉致病力，表明PsXEG1参与大豆疫霉的致病过程。PsXEG1的过表达转化子在侵染位点诱发了活性氧的积累和胼胝质的沉积，表明大豆疫霉侵染大豆过程中PsXEG1能诱发植物的PTI。PsXEG1蛋白体外处理大豆黄化苗诱发大豆对大豆疫霉的抗性，表明大豆识别PsXEG1诱发的PTI免疫反应能抑制大豆疫霉的侵染。大豆疫霉RXLR效应蛋白在本氏烟和大豆上都能抑制PsXEG1触发的过敏反应，并且部分效应分子也在侵染初期上调表达，表现出和PsXEG1类似的表达模式，表明在大豆疫霉与大豆的实际互作过程中，大豆疫霉的效应分子能够完成对PsXEG1诱发免疫的抑制。以上结果表明，大豆疫霉在侵染大豆的过程中PsXEG1能发挥毒性功能，帮助病原菌进行侵染;而植物能够识别该蛋白并触发免疫反应，进而抑制病原菌的侵染;病原菌为了克服植物的免疫反应，进化出效应分子来抑制PsXEG1触发的免疫反应帮助病原菌完成侵染。

著录项

作者
马振川;
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作者单位

南京农业大学;

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授予单位南京农业大学;
学科植物病理
授予学位博士
导师姓名王源超;
年度 2015
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类大豆病虫害;
关键词
大豆疫霉菌; 大豆根腐病; 模式分子; 免疫反应;

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