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日本看麦娘(Alopecurus japonicas)对啶磺草胺的抗性研究

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摘要

第一章 文献综述

1.1 杂草抗药性概述

1.1.1 全球杂草抗药性的现状分析

1.1.2 杂草抗药性发生的原因

1.1.3 杂草抗药性机理

1.2 植物乙酰乳酸合成酶及其抑制剂的研究进展

1.2.1 乙酰乳酸合成酶的结构和功能

1.2.2 乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的开发和应用

1.2.3 乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂作用机理

1.2.4 杂草对ALS抑制剂类除草剂抗药性概述

1.3 植物谷胱甘肽-S-转移酶(GST)研究进展

1.3.1 植物谷胱甘肽-S-转移酶的结构

1.3.2 植物谷胱甘肽-S-转移酶的功能

1.3.3 植物谷胱甘肽-S-转移酶与抗性的研究

1.4 杂草抗药性研究方法

1.4.1 整株植物测定法

1.4.2 幼苗检测法

1.4.3 生理生化检测法

1.5 本研究的目的和意义

第二章 日本看麦娘对啶磺草胺的抗性水平测定

2.1 实验材料

2.1.1 供试日本看麦娘

2.1.2 供试试剂和仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 不同日本看麦娘生物型对啶磺草胺抗性水平

2.4 讨论

第三章 日本看麦娘乙酰乳酸合成酶ALS基因的克隆和表达分析

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 日本看麦娘材料和培养

3.1.2 菌株和质粒

3.1.3 化学试剂

3.1.4 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 ALS基因的克隆和序列分析

3.2.2 ALS基因的原核表达分析

3.2.3 ALS基因的定量表达分析

3.2.4 ALS酶活测定

3.3 结果与分析

3.3.1 不同生物型日本看麦娘总RNA提取

3.3.2 ALS基因的扩增

3.3.3 ALS基因的序列分析

3.3.4 ALS基因的原核表达分析

3.3.5 ALS基因的定量表达分析

3.3.6 ALS酶活测定

3.4 讨论

第四章 日本看麦娘谷胱甘肽-S-转移酶GST基因的克隆和表达分析

4.1 实验材料与试剂

4.1.1 植株材料和培养

4.1.2 菌株和质粒

4.1.3 化学试剂

4.1.4 实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 GST基因的克隆和序列分析

4.2.2 GST基因的定量表达分析

4.2.3 GST酶活测定

4.3 结果与分析

4.3.1 不同生物型日本看麦娘总RNA提取

4.3.2 GST基因的扩增

4.3.3 GST基因序列分析

4.3.4 GST基因的定量表达分析

4.3.5 GST酶活测定

4.4 讨论

全文总结

本文创新之处与不足之处

参考文献

附录

致谢

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摘要

日本看麦娘是我国麦田的恶性杂草,其分布广泛,严重降低了小麦产量和品质。啶磺草胺作为乙酰乳酸合成酶(简称ALS)抑制剂类除草剂的常用药剂,被广泛应用于小麦田防除日本看麦娘等禾本科杂草。其作用机制是通过降低杂草体内ALS活性,进而破坏体内支链氨基酸的生物合成,从而导致杂草枯萎死亡。本课题组通过前期的采样调查,已经发现了对啶磺草胺产生抗药性的日本看麦娘生物型。本文选取安徽天长地区的抗性日本看麦娘和敏感日本看麦娘为研究对象,通过测定其抗药性水平,分析比较不同生物型日本看麦娘的靶标酶ALS在基因序列、基因表达量、酶活方面的差异,以及代谢酶GST在基因序列、基因表达量、酶活方面的差异,以期阐述日本看麦娘对啶磺草胺的抗性机制。主要研究结果如下:
  (1)整株生物法测定结果表明,A生物型为敏感日本看麦娘,D生物型和E生物型为抗性日本看麦娘,其抗性倍数分别为46.4和56.7。
  (2)靶标酶ALS基因序列分析表明,日本看麦娘的ALS基因编码区序列长度1917 bp,编码638个氨基酸,理论分子量大小为43.77 KDa,等电点为8.47。通过比对发现,不同生物型日本看麦娘的ALS氨基酸序列相同,并未发生突变。
  (3)靶标酶ALS活性研究结果表明,日本看麦娘抗性生物型产生与其体内ALS活性变化紧密相关;啶磺草胺药剂处理前,抗性生物型D、E和敏感生物型A的ALS活性无显著性差异;啶磺草胺药剂处理后,敏感生物型A体内的靶标酶ALS活力明显受到抑制,而抗性生物型D和E仍能保持相对较高的ALS活性。
  (4)靶标酶ALS基因表达量研究结果表明,施药前三种生物型的ALS表达量无显著性差异;啶磺草胺处理后,抗性生物型D和E的ALS表达量先剧烈上升后降低,敏感生物型A的ALS表达量先降低再缓慢上升。
  (5)代谢酶GST基因序列分析表明,日本看麦娘的GST基因编码区序列长度660 bp,编码219个氨基酸,理论分子量大小为24.68 KDa,等电点为6.4。通过比对发现,不同生物型日本看麦娘的GST氨基酸序列相同,并未发生突变。
  (6)代谢酶GST活性研究结果表明,啶磺草胺药剂处理前后,抗性生物型D、E的GST活性均显著高于敏感生物型A;施药后,不同生物型的酶活变化也各有差异,抗性生物型D、E的GST活性先上升后下降且下降趋势平缓,而敏感日本看麦娘A的GST活性急剧下降,在整个处理时间内抗性生物型D和E的GST活性始终高于敏感生物型A。
  (7)代谢酶GST基因表达量研究结果表明,抗性生物型D、E和敏感生物型A的GST基因表达量有相似的变化趋势,表现出了表达水平先升高然后降低的趋势;但是抗性生物型D和E的GST表达量在处理后12 h后达到峰值,敏感生物型A在1d后达到峰值;处理15d后生物型A和D的GST基因表达量显著高于生物型E。
  综上所述,安徽天长地区的日本看麦娘对啶磺草胺产生抗药性可能与其体内靶标酶ALS对啶磺草胺敏感性的降低和代谢酶GST代谢能力增强相关。

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