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大豆中疫霉菌特异诱导性启动子的人工设计与功能研究

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摘要

引言

上篇 文献综述

第一章 启动子研究进展

1 启动子概述

2 诱导型启动子研究进展

第二章 实时定量PCR技术的研究进展

1 实时定量PCR的研究进展

2 内参基因的研究进展

参考文献

下篇 研究内容

第一章 大豆中疫霉诱菌特异诱导性启动子的人工合成和功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 实时定量PCR分析中大豆内参基因的筛选和验证

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

全文结论与创新点

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致谢

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摘要

大豆作为世界上一种非常重要的油料作物，在农业生产和人们生活中扮演着重要的角色。而由大豆疫霉引起的大豆根腐病是一种毁灭性的病害，每年都会造成巨大的经济损失。目前尚未有有效手段预防和控制该种病害的发生。近年来，越来越多的研究者将目光投向了基因工程，企图通过克隆抗病相关的基因，来推动大豆抗疫霉病的进程。而病原诱导型启动子的克隆与利用作为基因工程中重要的一部分，受到越来越多的重视。启动子的本质是一段存在于基因中的脱氧核苷酸序列。它的作用是与RNA聚合酶结合并开启下游基因的转录。诱导型启动子作为启动子的一种，广泛存在于植物的基因中。在受到特定诱导物刺激后，诱导型启动子活性增强，使得其下游基因的表达水平明显提高。诱导型启动子可以应用于基因工程中，为植物的抗胁迫和抗病作出贡献。本文通过对疫霉菌特异诱导型启动子的分析，得到了相应的疫霉诱导型启动子顺式元件，并对人工设计合成的启动子受疫霉诱导表达的情况进行了研究。同时，在研究中我们利用实时定量PCR进行实验时发现，大豆中仍缺少合适的内参基因，所以我们在大豆中进行了内参基因的筛选。
　　启动子中存在不同的作用元件，而元件间不同的位置及组合关系影响着启动子的特性。已有文章报道了不同作用元件对于启动子的重要性，它们可能在植物响应环境胁迫或病原物侵染等方面起着重要作用。在基因工程中，作用元件也被广泛应用于人工合成启动子中。本实验室已对超大规模基因芯片进行了分析，得到了不同大豆品系在疫霉接种前后不同时间点的全基因表达谱，并获得了180个疫霉诱导型基因。本研究在此基础之上，利用生物信息学方法对已获得的180个基因的启动子区进行了系统分析，找到了25个未报到过的结构元件，并对这些结构元件经行了设计和组合，构建成不同的合成启动子。在烟草瞬时表达体系中，对人工设计的启动子进行表达分析、功能验证与优化。通过实验我们得到了8个受疫霉诱导表达的人工合成启动子，为大豆转基因抗疫霉病害的品种设计提供了参考。
　　实时定量PCR可以在反应进行过程中对扩增产物进行实时的分析和检测，相较于常规的PCR通过终点法来检测分析扩增产物来说，实时定量PCR具有更高的效率。在实时定量PCR实验中，内参基因的选择非常重要，因为内参基因是用来作为目标基因表达量分析的标准。根据文献中关于大豆内参基因的研究，本实验以大豆的不同组织以及大豆疫霉诱导下大豆根为材料，使用荧光实时定量PCR方法分析了Cons4、ACT11、TUA soy、Cons15、ACT20、Cons7、CYP2、Cons6、Tubulin和ELF1B10个持家基因的表达情况。通过BestKeeper、GeNorm和NormFinder等3个常用内参分析软件的分析，发现Cons4基因在所有样品中的表达稳定性最好，其中Cons4、ACT11和TUA soy在大豆疫霉侵染过程中的大豆根中表达稳定性最好，而Tubulin和ELF1B在大豆的所有样品中表达稳定性较差。通过对大豆疫霉诱导性基因GmaPPO12和GmaPR1a的表达分析，进一步验证了上述结果。该研究为采用实时定量PCR的方法选择合适的内参基因提供了参考。

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