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【6h】

DETECTION OF Mycoplasma hyopneumoniae FROM SWINE CLINICAL SAMPLES USING AVAILABLE DIAGNOSTIC TOOLS

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TABLE OF CONTENTS

LIST OF FIGURES

LIST OF TABLES

ABSTRACT

摘要

ABBREVIATIONS

CHAPTER 1 LITERATURE REVIEW

Background

1.1 Taxonomy and nomenclature of Mycoplasma hyopneumoniae

1.2 Etiology and Growth characteristics of Mhyo

1.3 Transmission of Mycoplasma hyopneumoniae

1.4 Airborne transmission

1.5 Ecology,Biology and Pathogenesis of Mycoplasma hyopneumoniae

1.6 Economic impact of Mycoplasma hyopneumoniae in pig production

1.7 Methods of diagnosing Mycoplasma hyopneumoniae infection

1.8 Management of M.hyopneumoniae

Chapter 2 Comparative analysis of the detection and monitoring of Mycoplasma hyopneumoniae infection by Nested PCR(n-PCR)and Real time PCR(q-PCR)from field swine herds

Introduction

1 Materials and Methods

1.1 Sampling

1.2 DNA extraction

1.3 Detection of M.hyopneumoniae DNA

1.4 Results

1.5 Discussion

Chapter 3 Real Time PCR,Serology and Culture in the detection of Mycoplasma hyopneumoniae from field swine herds

1 Introduction

2 Materials and Methods

2.1 Materials

2.2 Sample collection and preparation

2.3 Sample analysis

3 Culture

4 Results

5 Discussion

Chapter 4 Detection of Mycoplasma hyopneumoniae antibodies in serum and oral fluids in pigs using ELISA

1 Introduction

2 Materials and Methods

2.1 Vaccination

3 Methodology

4 Results

5 Discussion

OVERALL CONCLUSIONS

INNOVATION

Publications

REFERENCES

ACKNOWLEDGEMENTS

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摘要

猪肺炎支原体(Mhyo)是引发地方性猪肺炎(EPP)的病原体,同时也是猪呼吸道疾病综合征(DRDC)发生的有力推动者,DRDC通过降低猪生产性能进而危害猪群。
  为了减轻和消除Mhyo感染的影响,一些基于以前研究的诊断方法在猪生产中已经得到应用,旨在建立猪群实时健康数据,并且取得了不同程度的成功。感染流行病学的复杂性使得难以完全消除Mhyo,这意味诊断和良好的管理是感染控制和减少疾病暴发的最好方法。本次研究旨在比较现有猪群健康数据的检测方法,提高我们对中国Mhyo传播和感染的认识。因此,进行以下试验步:
  ⅰ)比较巢式PCR和实时定量PCR对自然条件下猪群Mhyo的检测差异;
  ⅱ)比较实时定量PCR、ELISA和细菌培养对自然条件下猪群Mhyo的检测差异;
  ⅲ)比较不同样品尤其是血液和唾液中抗体存在及水平之间的差异。
  首先,我们检测鼻拭子样品,比较猪场Mhyo感染率。猪日龄分别为7,14,21,28,30,和35d,采用巢式PCR和实时定量PCR检测早期Mhyo感染程度,确定仔猪最易感染时间。其次,使用实时定量PCR、ELISA和细菌培养对8周龄仔猪进行检测,调查8周龄时感染Mhyo的猪是否会出现血清转阳现象,并且分析基于上述三种方法给出猪群健康数据的可行性。最后,比较鼻拭子、血液和唾液三种样品中抗体水平的差异。样品每周采集一次,共三周,用P97R1蛋白包被96孔板后进行间接ELISA检测抗体水平。
  本次研究结果如下:
  1、实时定量PCR检测优于巢式PCR
  实时定量PCR检测能力更强,所有日龄仔猪的303个样品中检出152个阳性样品(50.2%)。本次研究中,实时定量PCR敏感性体现在试验后1min即可检出10拷贝数的MhyoDNA/μl。巢式PCR检出38个阳性样品(12.5%),22个样品(7.3%)经两种方法检测均呈阳性,127个样品(41.9%)经两种方法检测均呈阴性。对7日龄和35日龄仔猪的样品进行实时定量PCR和巢式PCR检测,发现Mhyo感染率均最高,7日龄仔猪巢式PCR检测感染率为15.6%,实时定量PCR检测感染率为53.1%;35日龄仔猪巢式PCR检测感染率为18.4%,实时定量PCR检测感染率为56.6%.
  2、实时定量PCR检测优于ELISA和细菌培养
  实时定量PCR从102个样品中检出81个阳性样品(79.4%),而细菌培养Mhyo阳性检出率则为51%(52/102)且阳性样品CCU为10-7。细菌培养时培养基颜色变化时间是4-11d。然而,ELISA检测所有样品均为阴性,该结果与实时定量PCR检测结果匹配率为11/102(10.7%),远低于细菌培养与实时定量PCR的匹配率。
  3、ELISA检测唾液样品的结果和检测血液样品的结果具有相关性
  ELISA检测唾液时,第四组猪4周龄时的样品较3周龄样品吸光值降低16.7%,其余组猪4周龄时的样品较3周龄样品吸光值均显著升高。ELISA检测血液样品时,第四组猪4周龄样品较3周龄样品吸光值降低17.2%,其余组猪4周龄时的样品较3周龄样品吸光值均显著升高。两种样品检测结果一致。ELISA检测两种样品结果的相关系数分别为:3周龄时,r2=0.8400(p<0.0005);4周龄时,r2=0.3615(p<0.0868)(图4-4)。

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