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中国产部分禾本科植物内生真菌资源的探索

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摘要

第一部分 文献综述 禾本科植物内生真菌资源的探索

1 内生真菌的定义

2 早期的禾本科植物内生真菌研究

2.1 Acremonium属内生真菌

2.2 Neotyphodium属内生真菌

2.3 Epichlo?属内生真菌

3 禾本科植物内生真菌研究的新动向

3.1 内生真菌的功能及其化学背景

3.2 内生真菌的遗传及基因组

4 世界各地的禾本科植物内生真菌资源探索

4.1 欧洲的探索(18世纪90年代至今)

4.2 大洋洲的进展(20世纪40年代至今)

4.3 北美洲的探索(20世纪80年代至今)

4.4 日本的探索(20世纪80年代至今)

4.5 南美洲的探索(20世纪90年代至今)

4.6 中国的探索(20世纪90年代至今)

4.7 非洲的进展(21世纪至今)

5 不典型的epichloid内生真菌

5.1 生长速度极慢的内生真菌

5.2 不产孢的内生真菌

5.3 不种传的内生真菌

5.4 宿主范围特别广的内生真菌

5.5 产子座但无有性世代的内生真菌

6 禾本科植物内生真菌资源探索的热点—小麦族植物内生真菌

7 本研究的主要内容及其意义

参考文献

第一章 中国部分地区禾本科植物内生真菌的检测及其宿主植物鉴定

前言

1 材料与方法

1.1 植物样品的采集、保存

1.2 植物样品的鉴定

1.3 内生真菌的检测

1.4 植物样品总DNA的提取

1.5 植物叶绿体cpDNA中的trnT-trnL序列分析

1.6 植物叶片组织的透明化和观察

2 结果与分析

2.1 植物样品的采集及鉴定

2.2 内生真菌在宿主植物体内的形态特征

2.3 植物样品检出率的统计及分析

2.4 黄山大雀麦植物样品的调查

2.5 植物样品总DNA的提取

2.6 植物目的基因片段的比对及系统发育学分析

2.7 植物叶表皮微形态特征

3 讨论

参考文献

第二章 大雀麦和羊草菌株的分离及其形态学特征

前言

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.2 子座的观察及内生真菌的分离

1.3 分离菌株的形态学特征

2 结果与分析

2.1 黄山大雀麦内生真菌的分离、培养及保存

2.2 内蒙古羊草子座切片的观察及内生真菌的分离

2.3 内生真菌的菌落特征

2.4 内生真菌的无性形态特征

3 讨论

参考文献

第三章 大雀麦和羊草分离菌株的系统发育学特征

前言

1 材料与方法

1.1 供试菌株的培养

1.2 菌株总DNA的提取

1.3 供试菌株基因片段的PCR扩增及测序

1.4 菌株的序列比对和系统发育学分析

2 结果与分析

2.1 菌株总DNA的提取

2.2 引物的筛选及其有效性

2.3 目的基因片段的分析

2.4 菌株的系统发育学分析

3 讨论

参考文献

第四章 新种Neotyphodium magnicola H.Zhang,Z.Wang et Y.Ji,sp.nov.的提议

第五章 基于SRAP的遗传多样性分析

前言

1 材料与方法

1.1 供试菌株的种类、来源及其培养保藏

1.2 总DNA的提取、引物的筛选、SRAP扩增及产物检测

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 SRAP引物筛选、条带扩增

2.2 遗传距离分析

2.3 不同epichloid内生真菌种间的多样性

2.4 不同epichloid内生真菌种内的多样性

3 讨论

参考文献

综合讨论

参考文献

全文结论

攻读硕士期间发表的学术论文

附录

致谢

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摘要

在长期的进化过程中与冷季型禾本科植物形成互惠关系的Epichloid内生真菌(Epichlo(e)属和Neotyphodium属),其菌丝体系统分布于植物体的地上部分。目前,已报道内生真菌至少能感染80属280种禾本科植物,在欧洲和北美洲研究较多,我国较少。
  2011至2012年,本研究从江苏、安徽、浙江、辽宁、北京及内蒙古等6省市自治区采集禾本科植物2001株。依据健康植物的花序特征,鉴定植物样品含9属15种以上。内生真菌检出率从0~100%不等,植物样品的检出率在不同属间,以及同属内种间均存在差异,显示内生真菌的宿主特异性,总检出率为为35.4%。本研究首次从黄山地区采集到含菌的大雀麦(BromusmagnusKeng)植株,这在我国尚未有记录。
  2011年9月从内蒙古通辽的城区及科尔沁区采集着生真菌子座的禾本科植物44株,但没有采集到完整的花序。结合trnT-trnL片段分析、叶表皮微形态观察以及植株的营养器官形态特征,这些样品全被鉴定为羊草(LeymuschinensisTrin.)。野外条件下,内生真菌能在羊草植株上形成子座,至今国际上未见相关报道。
  以含菌的黄山大雀麦进行内生真菌的分离。根据形态学特征来自黄山大雀麦的31个菌株分为两群:生长速度(48.1~56.3mm/21d)快的FG菌群和生长速度慢(12.9~15.9mm/21d)的SG菌群,FG群菌株分生孢子(2.9~3.6×4.5~5.1μm)和分生孢子梗(15.8~24.6μm)等无性形态结构也比SG菌群略大。同一地区大雀麦分离菌株显示出形态多样性,SG菌群菌株22株,在数量上占据优势。选取具有代表性的6个菌株,进行tefA和tubB片段扩增、测序和系统发育学分析。单拷贝的大雀麦分离菌株在EBY分支上形成独立分支,区别于已报道的内生真菌。FG菌群和SG菌群菌株间未表现差异。结合宿主植物的种类和地理分布,分离菌株的形态学特征和系统发育学特征,提议大雀麦分离菌株为新种NeotyphodiummagnicolaH.Zhang,Z.WangetY.Ji,sp.nov.。
  由于采样时间较晚,羊草子座发育末期,子座特征不完整,未观察到成熟的子囊和子囊孢子。经表面消毒,从通辽的城区和科尔沁区分别分离菌株9株和16株,并对分离菌株进行形态学特征调查及系统发育学分析。通辽城区和科尔沁区的菌株形态学特征一致:生长速度为28.5~41.1mm/21d。分生孢子梗长24.1~26.4μm,基部宽2.1~2.5μm,顶端逐渐变窄小于1μm,基部有隔膜。分生孢子肾形至椭圆形,4.7~5.5×2.8~3.5μm。这些均为典型的epichloid内生真菌特征。选取具有代表性的6个菌株进行系统发育学分析,菌株均具有一个拷贝,在EBY分支上形成独立分支。这些菌株在形态学特征和系统发育学特征上区别于已报道内生真菌,可能属于一个新的epichloid内生真菌分类群。但由于缺乏有性世代,尚不能确定其分类地位。
  筛选出9对多态性好的引物对保藏及分离的22株菌进行SRAP扩增,分析菌株间的遗传多样性。22株菌的SRAP扩增片段遗传差异在0.000~0.876之间,显示出一定的遗传差异。宿主植物为鹅观草、圆柱披碱草的菌株聚类情况复杂,显示菌株间丰富的遗传多样性。宿主植物为羊草、大雀麦、小颖羊茅、臭草及羽茅的菌株各自形成独立分支,显示菌株的特异性。这些都表明我国禾本科植物内生真菌存在丰富的遗传多样性,内生真菌的种类和宿主植物的种类密切相关。本研究对禾本科植物内生真菌资源探索,利于掌握我国禾本科植物内生真菌资源的全貌,为有效利用这一新型微生物资源奠定基础。

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