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水稻4种类型细胞质雄性不育系及其保持系苗期识别标记的开发和应用研究

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摘要

缩略语

第一章 文献综述

第一节 杂交水稻品种鉴定和纯度分析技术的研究进展

1 形态鉴定法

2 生理学特性鉴定法

3 物理化学鉴定法

4 生化指纹图谱鉴定法

5 DNA指纹图谱鉴定法

第二节 水稻细胞质雄性不育和育性恢复的研究进展

1 水稻细胞质雄性不育和育性恢复基因的来源

2 水稻细胞质雄性不育育性恢复的遗传研究

3 水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理

第三节 本研究的目的和意义

第二章 苗期识别籼稻细胞质雄性不育系及其保持系的SCAR标记开发和应用

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 基于PCR-RFLP的珍汕97A和珍汕97B DNA多态性分析

2.2 OPA12扩增DNA片段的碱基序列分析

2.3 基于测序结果开发的SCAR标记对珍汕97 A和珍汕97 B的鉴别

2.4 利用TAIL-PCR解析OPA12的复链位置

2.5 基于TAIL-PCR结果设计的引物对珍汕97 A和珍汕97 B的识别

2.6 利用SCAR标记CHI20F3/CHI23R3对4对不育系和保持系单株叶片总DNA的扩增

2.7 利用SCAR标记CHI20F3/CHI23R3对汕优63组合的三系及F1和F2单株总DNA的扩增

2.8 利用SCAR标记CHI20F3/CHI23R3对人为掺杂珍汕97 B的珍汕97 A种子批的鉴定

3 讨论

第三章 基于功能标记区分水稻HL型和BT型细胞质雄性不育系和保持系幼苗的应用研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 HL-ORF79-1、HL-ORF79-2和HL-ORF79-3对粤泰A和粤泰B总DNA的扩增表现

2.2 BT-ORF79-1对8对BT型不育系及其保持系总DNA的扩增表现

2.3 利用BT细胞质功能标记BT-ORF79-1对人为掺杂武育粳3B的武育粳3A种子批的鉴定

3 讨论

参考文献

附录

致谢

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摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全球大约一半人口以稻米为主食。过去30多年的实践已经证明,杂交水稻是提高单产的成功技术。我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国,具有庞大的杂交水稻种子市场,每年需要杂交水稻种子约40万吨。随着杂交水稻种植面积的不断扩大,种子需求量增加,加之制种过程中往往出现机械混杂、生物学混杂,及不法经营者的人为掺杂,导致杂交种的纯度和真实性受到严重影响,造成严重减产。因此,种子纯度就成为生产上面临的一个突出问题。不育系混杂退化是引起杂交稻混杂退化的主要原因。不育系混杂了保持系,由于后者自交繁殖,不育系中的保持系将可能逐渐增加。用混杂有保持系的不育系制种,杂交一代将出现大量的不育株,影响水稻的杂种优势。然而,目前种子真实性和纯度鉴定多采用田间种植鉴定,该方法周期长,费工费时,不能满足种子市场销售和品种及时授权的需要。为开发早期能够稳定区分同核异质体的水稻细胞质雄性不育系和保持系的DNA分子标记,本研究在前期工作的基础上,开展了以下两个方面的研究:一是利用籼稻野败型细胞质雄性不育系珍汕97A及其同核保持系珍汕97B为材料,对RAPD引物OPA12在退火温度32℃~35℃条件下扩增的约1600 bp的DNA片段进行酶切、克隆、测序和TAIL-PCR分析,设计开发稳定再现的能够区分不育细胞质和可育细胞质的SCAR标记。二是以1对HL型细胞质雄性不育系和保持系,8对BT型细胞质雄性不育系和保持系,及2个恢复系9311和6427 R为材料,利用水稻细胞质雄性不育的特异嵌合基因设计开发的4对功能性引物,以总DNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,检测不育系和保持系苗期识别标记。同时对一份人为掺杂的100粒不育系种子批武育粳3A进行实地的验证。
   主要研究结果如下:
   1.7种识别4碱基的限制性内切酶(HapⅡ,HaeⅢ,AccⅡ,HhaⅠ,AluⅠ,RsaⅠ,TaqⅠ)酶切OPA12扩增珍汕97 A和珍汕97 B的扩增产物,没有检测到珍汕97 A和珍汕97 B之间的多态性。
   2.以线粒体DNA为模板,OPA12在珍汕97 A和珍汕97 B中均扩增出全长为1588 bp的条带,两者碱基序列完全一样。
   3.以线粒体DNA为模板,SCAR标记CHI19F2/CHI19R2在珍汕97 A中能扩增出清晰的1588 bp条带,而在珍汕97 B中没有扩增产物出现。
   4.以线粒体DNA为模板,基于TAIL-PCR结果设计的SCAR标记CHI20F3/CHI23R3,在珍汕97A中能扩增出预期的1588 bp的条带,而在珍汕97B中没有扩增产蝴。
   5.组合CHI20F3/CHI23R3与CHI19F2/CHI19R2,以总DNA为模板进行PCR反应,4对引物组合在珍汕97A中均能扩增出1588 bp的特异性条带,而在珍汕97 B中没有扩增出这条带。
   6.4对SCAR标记在野败型细胞质籼稻珍品A和珍品B、天丰A和天丰B、印尼水田谷型细胞质籼稻Ⅱ-32A和Ⅱ-32 B、以及汕优63的F1和F2单株检测中得到验证。
   7.用CHI20F3/CHI23R3对人为混杂的珍汕97A种子批检测结果与表型数据完全一致。这些结果表明CHI20F3/CHI23R3是能够用于种子或幼苗期鉴别野败型和印尼水田谷型细胞质雄性不育系和保持系的SCAR标记。
   8.HL-orf79-1、HL-orf79-2、HL-orf79-3在HL型不育系粤泰A中稳定地扩增出约239 bp的HL型细胞质雄性不育特异性条带,而在保持系粤泰B、恢复系9311和6427R中没有扩增出这条特异性条带。
   9.BT-orf79-1在8个BT型不育系BT型六千辛A、武羌A、863A、武育粳3A、731A、徐2A、9522A、18A中均扩增出特异性的239 bp的DNA片段,而在8个保持系六千辛B、武羌B、863B、武育粳3B、731B、徐2B、9522B、18B没有这条带。实验室对不育系纯度的鉴定结果与田间表型鉴定的结果完全一致。因此,来源于水稻不育细胞质线粒体基因组特有开放阅读框的239 bp的DNA片段,可以作为苗期区分水稻HL型和BT型细胞质雄性不育系和保持系的功能标记。

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