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一株乙羧氟草醚高效降解菌的分离鉴定、降解特性及其应用研究

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摘要

第一章 文献综述

1 二苯醚类除草剂简介

1.1 二苯醚类除草剂的分子结构及性质

1.2 二苯醚类除草剂的除草机理及作用方式

1.3 二苯醚类除草剂在环境中的降解动态

1.4 二苯醚类除草剂对环境的影响

1.5 二苯醚类除草剂的微生物降解研究进展

1.6 研究目的和意义

1.7 研究内容与技术路线

第二章 乙羧氟草醚降解菌的分离、鉴定及生长条件的研究

1 材料与方法

1.1 培养基

1.2 供试农药和试剂

1.3 降解菌的富集和划线分离纯化

1.4 降解菌降解效果的测定

1.5 乙羧氟草醚的提取和测定方法

1.6 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定

1.7 降解菌株的16SrRNA基因序列的测定

1.8 降解菌株系统发育分析

1.9 菌种制备以及菌体生长量、生长曲线的测定

1.10 不同培养条件对降解菌株生长的影响

1.11 数据分析方法

2 结果与分析

2.1 降解菌株的富集与划线分离纯化

2.2 菌株降解乙羧氟草醚性能验证

2.3 降解菌株菌落形态及生理生化特征

2.4 降解菌株的16SrRNA基因序列的测定

2.5 MBWY-1在LB培养基中的生长曲线

2.6 不同培养条件对菌株生长的影响

3 讨论

4 本章小结

第三章 乙羧氟草醚降解菌MBWY-1降解性能及土壤降解试验研究

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

1.2 供试农药和试剂

1.3 菌种制备以及菌体生长量的测定方法

1.4 乙羧氟草醚含量的测定

1.5 菌株MBWY-1生长与除草剂乙羧氟草醚降解关系

1.6 环境因素对菌株降解乙羧氟草醚性能的影响

1.7 乙羧氟草醚在土壤中的降解

1.8 数据分析方法

2 结果与分析

2.1 菌株利用乙羧氟草醚的生长降解曲线

2.2 环境因素对菌株降解乙羧氟草醚性能的影响

2.3 乙羧氟草醚在土壤中的降解实验

3 讨论

4 本章小结

第四章 菌株MBWY-1降解乙羧氟草醚的代谢途径分析及降解谱试验

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

1.2 供试农药和试剂

1.3 菌种制备以及菌体生长量的测定方法

1.4 乙羧氟草醚含量的测定

1.5 MBWY-1降解乙羧氟草醚代谢途径的研究

1.6 降解菌株对其他二苯醚类农药的降解

2 结果与分析

2.1 MBWY-1降解乙羧氟草醚的代谢产物质谱分析

2.2 乙羧氟草醚代谢途径的初步确定

2.3 降解菌株对其他二苯醚类农药的降解

3 讨论

4 本章小结

第五章 海藻酸钠包埋固定乙羧氟草醚降解菌及其降解性能研究

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基与试剂

1.2 固定化小球的制备方法

1.3 包埋条件研究

1.4 pH稳定性和温度稳定性实验

1.5 乙羧氟草醚含量测定

1.6 数据分析方法

2 结果与分析

2.1 包埋条件研究

2.2 pH稳定性和温度稳定性实验

3 讨论

4 本章小结

第六章 全文总结与展望

1 全文结论

2 论文创新点

3 研究中的不足

4 研究展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文和专利申请

致谢

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摘要

本研究从生产乙羧氟草醚的农药厂污水处理池的污泥中,分离得到一株能以乙羧氟草醚为唯一碳源生长的高效降解菌株,命名为MBWY-1。根据其表型特征、生理生化特性,结合菌株的16S rRNA基因序列同源性比较,最终鉴定菌株MBWY-1为分枝杆菌属(Mycobacterium phocaicum)。
   菌株MBWY-1在LB液体培养基中培养17h时,菌株生长最快,在19h后逐渐进入稳定生长期;菌株的最适生长温度和pH分别为30℃,6.5~7.0;装液量越多,营养越充足,菌株生长越旺盛,溶解氧越多,对菌株的生长越有利;NaCl浓度对菌株生长的影响很大,随着NaCl浓度增大,菌株生长逐渐受到抑制,当达到4.0%时,菌株在高盐的胁迫下,生长几乎停滞;菌株MBWY-1能在试验中大多的有机碳源中生长,其中在木糖、果糖和葡萄糖的LB培养基中生长较好,但是对无机碳源碳酸钾和碳酸氢钠则几乎不利用;菌株对试验中所有形式氮源利用率都比较高,其中对有机氮源蛋白胨利用率最高;菌株对氯霉素、羧苄青霉素、羟氨苄青霉素均有抗性,对卡那霉素没有抗性,对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素较为敏感。
   菌株在培养基中培养32h后对100 mg/L的乙羧氟草醚降解效果可达51.9%,96h后达到91.6%;培养液中的菌株光密度随着乙羧氟草醚的降解相应的逐渐上升,表明菌株以乙羧氟草醚为唯一碳源进行生长。菌株MBWY-1在30℃、pH6.0~7.0条件下降解效果最好;溶解氧量越多降解效果越好。菌株接种量越大,乙羧氟草醚的降解速率和降解率越高。乙羧氟草醚的起始浓度越低,越容易被菌株利用,降解较快;随着初始浓度的提高,菌株将其完全降解的时间也不断增加。所有试验重金属(除Ba2+、Cu2+、Ag+)浓度为0.1mM/L时,对菌株降解乙羧氟草醚影响均比较小,当浓度达到10 mM/L时,都会在不同程度上抑制乙羧氟草醚的降解,其中高浓度的Cu2+、Ag+、Co2+对菌株的降解影响最大。
   土壤空白添加浓度为1、5、20mg/Kg时,乙羧氟草醚在土壤中平均添加回收率较高,在87.8%~92.3%之间,土壤回收的相对标准偏差在1.76%~4.41%之间。投加外源降解菌MBWY-1可显著提高土壤中乙羧氟草醚的降解率,土著微生物参与乙羧氟草醚的微生物降解;土著微生物与外源投加的降解菌以协同作用的方式降解乙羧氟草醚,提高了土壤中乙羧氟草醚的降解速率。
   通过质谱检测出了乙羧氟草醚的5种降解产物分别为:{5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酰基}羟基乙酸,5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸,即三氟羧草醚,5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基,5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-羟基,3-氯-4-羟基三氟甲苯。同时确定了其降解途径:苯环上链烷基的第一个和第二个酯键相继水解断裂生成三氟羧草醚,然后三氟羧草醚脱去羧基,进一步再将硝基还原为羟基生成5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-羟基,最后醚键断裂生成两分子的苯环类衍生物——3-氯-4-羟基三氟甲苯和对苯二酚。菌株降解谱试验结果显示该菌株只能降解乙羧氟草醚农药,对另外两种二苯醚类除草剂(三氟羧草醚、氟磺胺草醚)却不能降解。
   海藻酸钠浓度为4.0%,CaCl2浓度为3.0%,固化时间为16h时,制得的固定化小球机械强度最好,同时包菌量选择5.0%对乙羧氟草醚的降解最有利,固定化菌株抗pH、温度变化能力比游离态菌株强。

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