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Pseudomonas putida DLL-E41,2,4,-苯三酚1,2-双加氧酶的晶体结构及两种农药降解相关酶的蛋白质晶体学研究

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微生物在污染环境的生物修复方面具有重要作用,它们对环境污染物的降解是通过一系列酶来进行的.因此,研究污染物降解过程中关键酶的作用机理,对于阐明微生物对污染物的生物降解过程以及生物修复机制具有重要意义。蛋白质晶体学是利用X-射线衍射技术对蛋白质的结构进行解析的一门学科,它能使我们从原子角度了解蛋白质的结构信息,结合蛋白质的功能特性,可以确定在实际催化过程中的功能基团及其作用方式,为定向改造提供重要信息.本文解析了4-硝基酚类污染物降解途径中涉及的1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶PnpC在两种不同结晶条件下获得的蛋白质晶体的三维结构,并对4-硝基酚类污染物降解过程中涉及的脱硝基酶PnpA,以及在除草剂阿特拉津降解中的脱氯酶AtzA进行了初步晶体学研究。
　　 对硝基苯酚(PNP)是一种重要化工原料,也是多种有机磷农药降解的中间产物,进入环境的PNP会残留在土壤和水体中,对动植物和人类的健康造成严重危害。PnpC和PnpA是甲基对硫磷降解菌Pseudomonas putida DLL-E4代谢对硝基苯酚类污染物途径中的两个关键酶。PnpC作用于1,2,4-苯三酚的1,2位,使其开环形成马来酰乙酸。
　　 通过Ni-NTA亲和层析及Superdex-200分子筛对重组表达于E.coli BL21(DE3)pLysS中的PnpC进行纯化,纯酶使用坐滴气相扩散法利用Hampton research结晶试剂盒对纯PnpC进行结晶条件筛选,优化并获得了两种不同结晶条件下的晶体.两种结晶条件下所用蛋白质浓度均为8 mg/mL,结晶池母液分别为:(Ⅰ)0.1 M Tris-HClpH7.5,1.3 M硫酸铵和(Ⅱ)0.1 M Hepes·pH7.5,0.8 M柠檬酸三钠。以硫酸铵为沉淀剂结晶出的晶体用缓冲液溶解后仍具有酶活力,晶体能衍射到2.32(A),空间群为C121,晶胞参数为a=82.48,b=38.47,c=107.98,α=90.00°,β=118.06°,γ=90.00°；以柠檬酸三钠为沉淀剂结晶出的晶体用缓冲液溶解后失去酶活力,晶体能衍射到1.99(A),空间群为C121,晶胞参数为a=82.57,b=38.93,c=107.36,α=90.00°,β=118.05°,γ=90.00°。两种条件下的晶体结构在每个不对称空间中均只有一个分子,含水量均为46％。通过分子置换,利用来源于Nocardioides simplex3E中的1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶(PDB登记号:1TMX,40％一致性)的结构为模板,解析出这两种不同结晶条件下晶体的三维结构。
　　 PnpC的主体由6个较长α螺旋、7个β折叠及转角组成,其主链走向与1TMX的主链走向一致。PnpC结构分为2个结构域:N端α螺旋结构域(NHD)和C端催化域(CCD),处于CCD的活性中心的四个氨基酸残基分别为:TYR160、TYR194、HIS218以及HIS220,其中TYR160和HIS218处于同一个平面,并垂直于TYR194和HIS220所在的平面。PnpC的二聚体模型中,两个单亚基NHD的H1、H3、H4、H5、H6、H7互相作用构成二聚体的连接区,而且在连接区的中心有一个疏水通道,有两个长链磷脂分子贯穿疏水通道,它们的疏水尾部在通道的中心,亲水区在疏水通道的外部。在两个单亚基NHD组成的连接区里,一个亚基中的H1和另外一个亚基中的H6距离接近,两个亚基的H3互相靠近并且反向平行,通道口由H3、H4及H7构成,H4、H5中的部分氨基酸残基参与了通道的构成,H5、H7距离CCD的活性中心氨基酸接近。疏水通道主要由两个亚基分别提供以下氨基酸残基组成:PHE28、ILE31、LEU35、LEU39、PHE42、LEU48、ILE57、PHE59、LEU60、LEU78、LEU82、ILE76以及ALA208。
　　 PnpC蛋白在两种不同结晶条件下的结构的活性中心的四个氨基酸残基之间的距离不同,以柠檬酸三钠作沉淀剂的晶体结构中,TYR160和HIS218的距离为2.46(A),TYR194和HIS220的距离为4.23(A),而以硫酸铵作沉淀剂的晶体结构中,TYR160和HIS218距离为2.33(A),TYR194和HIS220的距离为4.70(A)。它们的疏水通道中心的磷脂类尾部也有区别,柠檬酸三钠结晶的晶体的结构该区域可能连接有一个benzo类似物,并且和两个分子中的LEU35有作用,而以硫酸铵作沉淀剂的晶体结构中则没有.
　　 利用 pET表达系统构建了表达从PnpC蛋白质序列N端开始,依次截短23、46以及64个氨基酸的三个表达质粒,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中对它们进行表达。它们的表达产物分别对应于从PnpC蛋白质的N端结构域中截去一个,两个、三个组成连接区的较长α螺旋的突变体,这些表达产物均失去了催化1,2,4-苯三酚分解的能力。这表明,PnpC NHD的三个α螺旋对PnpC的催化能力是必需的。
　　 对硝基苯酚-4-单加氧酶(PnpA)是一个FAD依赖性单加氧酶,它在NADH和FAD存在下,通过加氧作用使PNP脱硝基生成苯醌。通过Ni-NTA亲和层析以及分子筛对重组表达于E.coli BL21(DE3)pLysS中的PnpA蛋白质进行纯化。利用坐滴气相扩散法在293 K初筛并优化获得一个PnpA的结晶条件:蛋白质浓度为10 mg/mL,结晶池母液为0.1 M Hepes pH7.0,15％PEG4000。该条件下长出的晶体能衍射到2.24(A),空间群为P212121,晶胞参数为:a=54.47,b=77.56,c=209.17,α:90.00°,β=90.00°,γ=90.00°。通过分子置换找出了PnpA结构的部分主链。另外还采集到PnpA浸泡底物PNP、4-NC以及KI的衍射数据,而且浸泡KI的数据中检测到有异常散射信号。
　　 阿特拉津是国内外使用时间长、使用量大的除草剂之一,它的使用已经造成了大面积的土壤、水体的污染。阿特拉津脱氯酶(AtzA)催化阿特拉津脱去氯原子,变成毒性较低的羟基阿特拉津。关于AtzA酶学以及生物修复方面的研究较多,但仍未有结构报道。从阿特拉津降解菌Pseudomonas sp.SA1中扩增出阿特拉津脱氯酶基因atzA,构建表达载体 pET29b-atzA,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行了高效表达,通过硫酸铵沉淀、离子交换、分子筛对其进行了纯化,纯酶在293K条件下使用悬滴气相扩散法和坐滴气相扩散法均能筛选到蛋白质晶体,优化获得的较稳定结晶条件下,晶体能衍射到4(A),蛋白质浓度为10 mg/mL,结晶池母液为0.1M柠檬酸三钠pH5.6、12％MPD以及13％PEG4000.
　　 综上所述,本文解析了两种不同结晶条件下的1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶PnpC的蛋白质晶体结构,比较了它们之间的结构学区别；通过截短实验发现PnpC N端远离活性位点的螺旋区对维持酶的活力是必需的.获得了4-硝基苯酚-4-单加氧酶(PnpA)有较好衍射的蛋白质晶体以及阿特拉津脱氯酶(AtzA)的较稳定的蛋白质晶体。

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