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家蚕皮肤胰蛋白酶抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂的初步分离纯化及性质研究

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第一章文献综述

一家蚕概述

二蛋白酶抑制剂及其研究进展

1蛋白酶抑制剂的类型

2蛋白酶抑制剂的作用机制

3.蛋白酶抑制剂的应用

4家蚕蛋白酶抑制剂研究概况

5家蚕蛋白酶抑制剂存在的生理意义

三、血管紧张素转化酶抑制剂及其应用研究进展

1 ACEI的分类

2 ACEI的作用机制

3 ACEI的药理学研究

4副作用

参考文献

第二章家蚕皮肤胰蛋白酶抑制剂的初步分离纯化及性质研究

1材料和方法

1.1材料

1.2试剂与仪器

1.3蛋白样品提取液的制备

1.4家蚕皮肤TI粗酶液的制备

1.5家蚕皮肤TI的初步纯化

1.6蛋白含量的测定

1.7 PAGE

1.8家蚕皮肤TI活性的测定

1.9家蚕皮肤TI热稳定性实验

2结果与讨论

2.1明胶-PAGE活性电泳检测胰蛋白酶抑制剂最适条件的建立

2.2粗提液的制备和抑制活性的测定

2.3明胶-PAGE活性染色电泳测定胰蛋白酶抑制剂活性的可行性的理论依据

2.4粗酶液的胰蛋白酶抑制剂的热稳定性实验

2.5家蚕皮肤粗酶液的初步纯化

3.本章小结

参考文献

第三章家蚕皮肤血管紧张素转化酶抑制剂的检测及初步分离纯化

1实验材料和方法

1.1实验材料

1.2实验仪器

1.3家蚕皮肤粗酶液的制备

1.4粗酶液的初步纯化

1.5蛋白含量测定

1.6 ACE酶液的提取

1.7 ACE酶活力的测定

1.8卡托普利对ACE的抑制作用

1.9以FAPGG为底物测定家蚕皮肤粗酶液对ACE抑制作用

2结果与讨论

2.1结果计算

2.2 血管紧张素转化酶抑制剂体外活性测定方法的评价

2.3家蚕皮肤粗酶液对血管紧张素转化酶抑制作用

2.4经过DEAE-52纤维素层析纯化后洗脱峰对ACE的抑制作用

3.本章小结

参考文献

全文结论

创新之处

致谢

攻读学位论文期间发表的论文

附录

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摘要

家蚕(Bombyx moti),也叫桑蚕,属于无脊椎动物,昆虫纲,鳞翅目,家蚕蛾科。当家蚕遇到外界的物理、化学和生物等因素的刺激后,其血淋巴中很快出现一系列免疫物质如抗菌蛋白、抗菌菌多肽、溶菌酶及凝集素等抗菌物质以对抗外源微生物的人侵,而这些抗菌物质可望成为一类新的高效低毒的抗菌、抗病毒和抗癌新药,为了研究家蚕皮肤中是否存在这种抗菌物质或者具有其它药用价值的组分,本论文主要检测了家蚕皮肤中的胰蛋白酶抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂并对其进行了初步的分离纯化和陛质研究,主要内容如下: 1.家蚕皮肤胰蛋白酶抑制剂的初步分离纯化及性质研究 以家蚕为实验材料,从家蚕皮肤中部分纯化出一种胰蛋白酶抑制剂,并对其性质进行了初步的研究。 抽提家蚕皮肤和体液组织总蛋白,通过检测不同的胰蛋白酶、明胶浓度以及酶解时间对电泳的影响,确立了进行活性电泳的最适条件为:活性电泳时分离胶中含有0.075%的明胶,电泳结束后用0.1mg/ml胰蛋白酶酶解1h。 家蚕皮肤总蛋白样品抽提液经70%硫酸铵沉淀盐析,透析脱盐后得到粗酶液。利用明胶-PAGE活性电泳研究家蚕皮肤粗酶液中胰蛋白酶抑制剂的种类以及各抑制剂的热稳定性。粗酶液中共检测到8种胰蛋白酶抑制剂,大多数抑制剂均具有一定的热稳定性,40℃处理后活性几乎不受影响,50℃处理后活性减弱,60℃以上多数抑制剂活性完全丧失,但有两种抑制剂具有较高的热稳定性,经过100℃煮沸后其活性几乎不受影响。 进一步利用DEAE-52纤维素离子交换层析对粗酶液进行纯化,用含不同盐浓度的缓冲液分步洗脱,分别收集各洗脱峰,透析脱盐,PEG20000浓缩后用明胶-PAGE活性电泳检测纯化结果。粗酶液中的胰蛋白酶抑制剂主要集中在0.1 M NaCl和0.2 MNaCl洗脱峰中,其中0.1 M NaCl洗脱峰主要含有一些热稳定性相对较高的抑制剂种类。 2.家蚕皮肤血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的检测和初步分离纯化 用两种不同底物分别测定血管紧张素转化酶的活性,评价了血管紧张素转化酶抑制剂体外活性筛选的适用范围。用两种方法分别测定ACE和ACE的专一性抑制剂卡托普利的抑制活性,两种方法测定的结果一致,且卡托普利的IC<,50>和文献报道的一致。 利用上述模型检测到家蚕皮肤粗酶液中存在天然的血管紧张素转化酶抑制剂,粗酶液经过DEAE-52纤维素进一步纯化,发现上述抑制剂活性主要分布在0.1 M NaCl的洗脱峰中,说明家蚕皮肤中存在的血管紧张素转化酶抑制剂可能是蛋白或多肽,而非无机或有机化合物。

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