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猪链球菌PCR检测方法的建立及纤连蛋白结合蛋白的克隆和表达

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第一章文献综述 猪链球菌病的研究进展

第二章猪链球菌及其主要致病血清型多重PCR检测方法的建立

第三章猪链球菌2型及其主要毒力因子多重PCR检测方法的建立

第四章猪链球菌2型四川人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白基因的克隆和序列分析

第五章纤连蛋白结合蛋白的克隆和表达

全文总结

致谢

攻读硕士学位期间发表的主要论文

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摘要

猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是重要的人兽共患病的病原，能引起猪和人类的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡，对养猪业造成巨大的经济损失。迄今为止，根据SS英膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)抗原性的不同，可将其分为35个血清型(1～34，l／2)，主要致病血清型为SSl、SS2、SSl／2、SS7、SS9和SSl4，其中以SS2流行最广、致病性最强。研究发现，并不是所有的SS2都有致病性，菌株致病性强弱与其是否表达毒力相关因子有很大关系。目前，已知的与SS致病性相关的毒力因子主要有英膜多糖、溶菌酶释放蛋白(muraminidase releasedprotein,MRP)、胞外因子(extracellular factor,EF)、溶血素(suilysin,Sly)、和IgG结合蛋白、44000的蛋白等，在SS致病方面一般都是协同发挥作用。对于SS检测和分型，国内研究主要针对SS2，所以本试验第一部分中，根据Genbank中gdh、cpsl、cps2、cps7、cps9和mrp、epf(epf<'*>)、sly设计引物建立两个多重PCR，希望实现对SS系统的检测。此外，近年来发现SS一种新的毒力因子—纤连蛋白结合蛋白。作为一种值得重视的细菌非菌毛黏附素，它普遍存在于SS的除32和34型以外所有血清型中。有研究说它可以作为交叉保护性抗原，有望用于SS的检测和免疫等方面。本试验第二部分是以四川资阳人源分离株为模板进行的表达纯化等工作。1SS及其主要致病血清型多重PCR检测方法的建立根据SS谷氨酸脱氢酶基因和血清型1型、2型、1／2型、7型、9型和14型英膜多糖编码基因核酸序列，分别设计SS型通用引物和型特异性引物，建立、优化多重PCR检测方法，并检测分析种属背景明确的菌株73株(其中猪链球菌49株、其他对照菌株24株)及临床分离样本94株(包括四川资阳人源和猪源临床分离样本45株)。其中73株种属背景明确菌株多重PCR种检测结果符合率为87.5％，6种主要致病血清型检出率可达率为100％。24株对照菌株在种和血清型水平均检测为阴性。对45株四川猪链球菌病暴发现场分离菌株进行检测，其中41株为SS2。上述结果提示本试验建立的多重PCR方法，可确定被检测SS是否属于主要致病血清型，特异性和敏感性好，可用于猪链球菌病的快速诊断和流行病学调查。 2 猪链球菌2型及其主要毒力因子多重PCR检测方法的建立 研究发现，并不是所有的SS都有致病性，菌株致病性强弱与其是否表达毒力相关因子有很大关系。有鉴于此，本研究拟建立多重PCR检测方法，旨在实现多种主要毒力相关因子基因的同步检测。根据ss毒力相关因子基因cps、mrp、epf和sly序列，设计和合成4对特异性引物，扩增目的片段预期大小分别为557bp、970bp、744bp(1396 bp、1622 bp、2431 bp、2655 bp、3111 bp)和622 bp。通过扩增体系和条件优化，建立了多重PCR体系，并对72株(其中48株为猪链球菌，24株为其他群的链球菌)种属资料确定的分离菌株和临床分离样本94株(包括四川资阳人源和猪源临床分离样本45株)进行检测分析。48株SS中，cps2检出率为16／48、mrp检出率为14／48、epf检出率为12／48、epf<'*>检出率为3／48、sly检出率为26／48，上述检测结果与背景已知菌株的毒力因子表达情况完全相符；四川猪链球菌病爆发现场分离的45株菌株中，41株为猪链球菌2型；24株种属已知菌株(大部分为其他群链球菌及金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、流感嗜血杆菌等)和49株猪源链球菌的临床分离样本毒力因子检测结果均为阴性。建立的多重PCR可用于ss毒力相关因子cps2、mrp、epf,sly的检测，特异性和敏感性好，为SS主要毒力因子快速诊断和分子流行病学调查提供了快速、可靠的方法。 3 猪链球菌2型四川人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白基因的克隆和序 列分析 针对05年SS2四川资阳人源分离株ZYHl8纤连蛋白结合蛋白(FBPS)基因进行克隆和序列分析。以ZYH18的基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白基因片段，克隆于pMD-T18载体，构建成载体pMD-T-fbps，转化到宿主菌TG1中，进行序列测定(GenBank登录号为DQ345444)。测序结果与实验室保存的其他7株SS2临床分离菌株测序结果及GenBank提交序列AF438158进行编码区基因的同源性比对。实验室保存的8株SS2的FBPS编码区基因同源性高达100％，并无分离时间和地点上的差异；与GenBank提交序列AF438158同源性为99％，仅存在两个氨基酸的不同。 4 纤连蛋白结合蛋白克隆和表达 根据SS2四川资阳人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白(FBPS)基因序列分析结果，设计合成了一对表达引物，以ZYH18基因组为模板，对fbps基因247-1969位序列扩增，以pGEX4T-2为载体，转化到宿主菌BL21中。经IPTG诱导可表达分子量约为86kD的融合蛋白。免疫转印分析表明，该融合蛋白具有FBPS的抗原表位。

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