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基因佐剂GM-CSF与生长抑素共表达基因疫苗的构建及其对仔猪的促生长作用

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摘要

本论文采用基因工程、分子生物学、细菌培养、细胞培养、ELISA、Western-blotting等技术，以pIPES为载体，分别将含有乙肝表面抗原的生长抑素(SS)基因和粒细胞·巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)连接到载体的多克隆位点B和多克隆位点A上，从而同时表达这两种蛋白，旨在研究该基因疫苗对仔猪的促生长作用。
　　 从pVGS/2SS-asd基因上通过PCR的方法，分别获得目的片段GM-CSF和2SS基因。将pIRES载体的MCSA位点用NheⅠ和EcoRⅠ酶切开，将GM-CSF片段插入。然后在MCSB位点用NotⅠ、SalⅠ酶切开，将2SS基因片段插入其中。并将构建好的质粒命名为pIRES-GM-CSF/2SS，获得质粒后，通过酶切和测序鉴定基因的正确性，测序结果显示基因序列完全正确。
　　 通过RT-PCR试验，确定GM-CSF蛋白和生长抑素蛋白可以在RNA水平上表达，通过Western-blotting检测，生长抑素基因和GM-CSF基因能在蛋白水平表达，从而确定该质粒可以在真核细胞中表达。
　　 选择来源、体重相近的28日龄的杜×长×大断奶仔猪40头随机分为4个组，每组10头，其中A组为对照组，B、C、D组为试验组、A组肌肉注射生理盐水，试验组分别肌肉注射不同剂量的pIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗，免疫剂量分别为0.25 mg、0.5 mg和1.0 mg，第一次免疫加入DDA佐剂，15 d后同样剂量加强免疫1次，但没有加入DDA佐剂。检测仔猪的生长抑素抗体水平、仔猪增重和料重比等指标，研究该基因疫苗对仔猪的促生长作用。结果表明：
　　 1.pIRES-GM-CSF/2SS疫苗免疫后对仔猪的死亡率和腹泻率的影响
　　 该疫苗经过去内毒素处理，免疫断奶仔猪后，仔猪的死亡率和腹泻率为0。
　　 2.对仔猪血浆中生长抑素抗体的影响
　　 在试验第15 d，与对照组(A组)相比，B、C和D组的抗体水平分别提高了11.33％(P>0.05)、20.0％(P>0.05)和62.67％(P<0.05)，并随着注射剂量的增加，抗体也有所提高。
　　 第30d，与对照组(A组)相比，B、C和D组的抗体水平分别提高了15.74％(P>0.05)、14.81％(P>0.05)和8.33％(P>0.05)，差异均不显著。
　　 3.对仔猪增重的影响
　　 在注射疫苗0-15 d，与对照组相比，B、C和D组的日增重分别提高了35.88％(P<0.05)、21.17％(P>0.05)和25.61％(P>0.05)。B、C和D组的料重比分别提高了16.67％、10.0％和4.67％。
　　 在试验的15-30 d，与对照组相比，B和C组的日增重有所降低，D组日增童提高了6.35％。B、C和D组料重比分别提高了5.06％、7.30％和3.37％。
　　 从全期来看，A、B、C和D组的日增重分别为491.00g、521.33 g、517.67 g和554.00g。与对照组相比，B、C和D组日增重分别提高了6.18％、5.43％和12.83％。A、B、C和D组的料重比分别为1.66、1.50、1.53、1.60，与对照组相比，B、C和D组料重比分别提高了9.64％、7.83％和3.61％。
　　 综上所述，通过酶切和测序试验证明pIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗的构建是正确的；Western-blotting、ELISA试验证明基因疫苗的GM-CSF基因和SS基因可以在蛋白水平上表达；通过动物试验，这种基因疫苗可在一定程度提高仔猪的日增重和料重比，与其他剂量组相比，0.25 mg/头为适宜剂量。

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