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人工昼夜节律对鼠视网膜发育与生物钟基因CRY1表达的影响及中医阴阳钟调整干预作用的研究

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本课题采用动物实验的研究方法,探讨在改变了自然昼夜节律的人工光环境下,大鼠视网膜的形态、功能改变与视网膜生物钟基因Cry1的表达,同时观察应用夏桂成老中医阴阳钟调整理论对视网膜光损伤及视网膜钟基因表达的保护与调整作用。
　　 目的：通过动物实验的方法探讨人工昼夜节律对SD大鼠视网膜功能、形态以及视网膜生物钟基因Cry1的影响,并观察夏桂成阴阳钟调整理论对视网膜光损伤的保护与生物钟基因的调整作用。
　　 方法：健康无眼病的雄性SD大鼠48只,随机分成4组,每组12只。对照组饲养在正常昼夜交替节律的环境中,接受自然光线的照射;实验组分为模型组,和A、B两个中药组,饲养在人工昼夜节律环境下,接受人工光源的循环照射,设定每日的光照时间为:明(早6:00至晚24:00),暗(晚24:00至早6:00),循环交替时间为18h/6h。根据夏桂成阴阳钟调整理论及其所拟补阳、补阴两种复方中药制剂每日灌胃两次,出于对大鼠昼伏夜出生活习性的考虑,中药A组大鼠予以上午10:00补阳方灌胃,夜晚22:00补阴方灌胃;中药B组大鼠予以上午10:00补阴方灌胃,夜晚22:00补阳方灌胃。实验第3月时,对各组大鼠行眼部常规检查、闪光-视网膜电图检查、视网膜HE染色光镜检查、透射电镜观察,Cry1免疫组化,视网膜钟基因Cry1提取。对实验光源日光灯进行光学参数的测定。
　　 结果：各组SD大鼠眼部前节组织结构检查未见明显差异。自然昼夜节律对照组大鼠HE染色光镜观察见视网膜各层间分界清晰,内、外核层细胞核排列整齐,有规则,外核层约排列10～12层胞核,内核层约排列4～5层胞核,内丛状层呈网状,比较疏松、比外丛状层厚,神经节细胞核淡染,在神经纤维层内散在分部。人工昼夜节律光环境模型组大鼠HE染色光镜下见视网膜萎缩变薄,结构不清,层数减少,外核层和内核层界限不清,细胞核层数明显减少,核层排列紊乱,核染色深,内丛状层变薄,外丛状层消失,神经纤维层变薄,神经节细胞稀疏。中药A组HE染色光镜下见视网膜层数减少,内、外核层细胞核层数减少,核染色深,与模型组相类似,程度略轻。中药B组大鼠视网膜普遍萎缩变薄,层数减少,外核层和内核层无明显分界,细胞核层数减少,核深染,排列紊乱,内丛状层变薄,外丛状层消失,神经节细胞水肿,稀疏,排列紊乱,神经纤维层可见水肿,变薄。
　　 自然昼夜节律对照组SD大鼠透射电镜下观察见视网膜神经节细胞呈椭圆形,细胞膜完整,细胞核染色质清晰,分布均匀,内质网及线粒体等细胞器形态正常,光感受器外节膜盘排列整齐,内节线粒体嵴连续,呈长圆形。人工昼夜节律光环境模型组透射电镜观察见视网膜神经节细胞胞质内有空泡样改变,内核层及外核层胞质均出现空泡样改变,线粒体肿胀,外节膜盘结构紊乱,板层轻度离散。中药A组透射电镜观察见视网膜神经节细胞椭圆形,形态基本正常,胞质内可见空泡样改变,内核层及外核层胞质内均有空泡样改变,个别线粒体肿胀,外节盘膜结构紊乱,板层结构轻度离散。中药B组见神经节细胞层胞质肿胀,大量空泡样改变,可见有细胞器褪变形成的髓样小体,内核层细胞胞质肿胀,呈大量空泡样,细胞膜破裂,外核层细胞胞质肿胀,大量空泡样改变,细胞排列紊乱,稀少,部分胞膜破坏,线粒体嵴断裂,高度肿胀,外节膜盘组织结构紊乱,板层结构消失,空泡样改变。
　　 自然昼夜节律对照组大鼠闪光-视网膜电图(F-ERG)检查波形为典型视网膜电图波形,各波分化性好。各实验组引出的波形均不典型。人工昼夜节律模型组与自然昼夜节律对照组F-ERG比较,Rod-R的b波潜时延长,Max-R的a,b波振幅下降,潜时延长,Cone-R的a,b波振幅下降,OpsOS值和30HzFlickerN1-P1振幅均下降,两组比较差异有显著性(P＜0.05)。中药A组与对照组大鼠F-ERG比较,Rod-R的b波潜时延长,Max-R的a,b波振幅下降,潜时延长,Cone-R的a,b波振幅下降,OpsOS值和30HzFlickerN1-P1振幅均下降,两组比较差异有显著性(P＜0.05)。中药A组与模型组大鼠F-ERG比较,Max-R的a,b波振幅升高,Cone-R的b波振幅升高,两组比较差异有显著性(P＜0.05)。中药B组与模型组大鼠F-ERG比较,Max-R的a波潜时延长,Max-R的b波振幅下降,差异有显著性(P＜0.05)。视网膜生物钟基因Cry1免疫组化定位于视网膜神经节细胞层。RT-PCR基因定量检测基因含量,模型组及中药A组含量减少,对与照组比较有显著性差异(P＜0.05),中药B组含量亦减少,但与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。自然节律对照组大鼠比较安静,实验组中中药A组大鼠比较安静。其余各组表现为比较惊觉,躁动不安。日光灯频闪大,稳定性差,紫外区的辐射非常明显。
　　 结论：日光灯人工昼夜节律循环照射大鼠,对视网膜的组织结构和功能有一定影响,遵循夏桂成老中医阴阳钟调整理论,中药A组阳时补阳药阴时补阴药可能对视网膜内层具有一定的保护作用,相反的中药B组阳时补阴药,阴时补阳药可能对视网膜有加大损伤作用,以上结论尚需进一步深入研究加以证实。顺应或违逆中医阴阳钟调整理理论可改善或加重大鼠生物节律的紊乱,保护或加重视网膜损伤,为临床上调节生物节律提供参考方法。人工光环境可能是引起视网膜疾病发病率增高的重要因素之一,有关发病机制还需进一步的探讨。

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