低剂量X射线照射对大鼠坐骨神经损伤后神经再生及背根神经节microRNA表达的影响

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第一部分低剂量X射线照射对大鼠坐骨神经横断损伤后神经再生及功能恢复的影响背景和目的：周围神经损伤后的修复与治疗，是医学界长期以来较为棘手的一个难题，也是医学界研究的热点和难点。尽管显微外科学的发展以及组织工程的出现，为周围神经损伤后的修复带来了佳音，但是目前其临床疗效仍不十分理想。近年来医学界一直在积极探索促进周围神经再生及加速功能恢复的治疗方法。物理因子疗法广泛而有效的治疗与康复作用，已被多年的临床实践所证实。电离照射作为物理因子家族中的一员，其治疗作用被越来越多的研究所报导。众所周知，中高剂量的电离照射往往会引起周围神经损伤和病变，低剂量电离照射（Low Dose Irradiation，LDI）能够使多种细胞的增殖加快，表现为兴奋效应。目前低剂量照射已用于预防瘢痕和骨折愈合的临床和实验模型。而有关低剂量电离照射影响周围神经损伤后神经再生的实验研究甚少。本研究拟通过低剂量X线局部照射干预周围神经横断损伤动物模型，观察低剂量X线照射对大鼠坐骨神经横断损伤后的神经再生和功能恢复的影响，以期为周围神经损伤后神经再生修复提供新的方法及理论依据。方法：选取两月龄Sprague-Dawley大鼠84只，体重250 g～300 g左右，随机分为2组：1 Gy照射组（实验组）和0 Gy照射组（对照组），每组42只。暴露大鼠左侧坐骨神经，显微剪刀横断神经后，采用神经外膜端端吻合法修复断裂神经，恢复神经的连续性。造模后24 h，实验组给予1 Gy剂量的X线单次局部照射，对照组不予以照射。照射后每周观察大鼠足部溃疡、步态、足部感觉、展爪反射等大体情况；照射后第4、8、12周测定大鼠坐骨神经功能指数；照射后3天和2周，应用Western blot和实时定量聚合酶链反应（ Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction ， qRT-PCR）测定大鼠坐骨神经标本内血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）和生长相关蛋白-43（Growth-Associated Protein-43，GAP-43）的表达水平；照射后第12周测定神经电生理评价神经功能的恢复情况；照射后第12周行组织学及免疫组织化学观察；照射后第12周行天狼星红染色检测神经吻合口处胶原纤维含量；照射后第12周行透射电镜检查观察神经超微结构变化，从形态学、功能学及分子生物学等方面评估低剂量X线照射对大鼠周围神经横断损伤后神经再生及功能恢复影响。结果： 1、大体形态观察：（1）足部溃疡：照射后第2周，两组大鼠左足部全部出现溃疡。照射后第3周实验组大鼠足部溃疡开始愈合，第4周对照组溃疡开始愈合，第6周实验组大鼠足部溃疡完全愈合，第8周对照组大鼠溃疡完全愈合，两组溃疡愈合时间比较差异显著。（2）足态：术后两组大鼠均出现左侧肢体完全瘫痪，足趾完全并拢，跖下垂、趾屈曲畸形，行走时左下肢在地上呈拖行状。实验组第10周时跖下垂、趾屈曲基本消失，足趾轻微并拢。对照组术后第12周跖下垂、趾屈曲较前好转，但均较实验组差。（3）足部感觉及展爪反射：照射后第2周及第4周两组大鼠展爪反射灵敏度观察无统计学差异。照射组术后第8周时5只反应为灵敏状态，至照射后第12周时7只展爪反射表现灵敏。对照组第8周时1只表现灵敏，至第12周时仅4只反应为灵敏状态。 2、VEGF和GAP-43测定：照射后第3天，实验组定量RT-PCR显示VEGF mRNA表达水平高于对照组，具有统计学意义（P<0.05）。照射后3天，Western blot显示实验组VEGF蛋白表达水平高于对照组，具有统计学意义（P<0.05）。照射后2周，定量RT-PCR显示，实验组比对照组GAP-43 mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。Western blot分析显示，实验组比对照组GAP-43蛋白表达显著增加（P<0.05）。 3、坐骨神经功能指数（SFI）：照射后第2周，由于各组大鼠均出现患足跖下垂、趾屈曲，各组SFI值无法测量计算。照射后第4周到12周SFI逐渐恢复，经统计学分析，第4、8周，各组SFI较前均有所好转。第4，8，12周，两组SFI值显示出不同程度的改善。与对照组相比，实验组SFI值显著升高（P<0.05）。 4、神经电生理检测：照射后第12周，两组大鼠运动神经传导速度显示出不同程度的改善。与对照组相比，实验组神经传导速度大鼠恢复更明显（P<0.05）。实验组复合肌肉动作电位（Compound Muscle Action Potential，CMAP）峰值幅度明显大于对照组（P<0.05）。实验组与对照组相比潜伏期更短。 5、组织学和免疫组织学观察：使用光学显微镜，横向坐骨神经的HE染色显示，在实验组中，少量深蓝色炎症细胞分散在轴突周围。可观察到周围组织粘连较轻、轻微的轴突变性、空泡化和较多的新生血管形成。可观察到再生的轴突和髓鞘。对照组中，大量的炎症细胞已经分布在轴突周围。观察到神经组织与周围组织粘连较重，更多的轴索变性、空泡化和较少的新生血管形成。与对照组相比，实验组的神经内膜空间略有增加。免疫组化结果显示：实验组S-100、NF-kb 蛋白表达分布均优于对照组。 6、天狼星红染色：在对照组（0 Gy）中，Ⅰ型和Ⅲ型胶原所占的平均面积比分别为（91.31 ± 9.58）%、（10.65 ± 1.06）%；而在实验组（1 Gy）中，Ⅰ型和Ⅲ型胶原所占的平均面积比分别为（57.40 ± 4.33）%、（44.16 ± 3.39）%，明显低于对照组（P<0.05）。 7、透射电镜观察：超微结构形态显示实验组可观察到较多正常的有髓轴突。再生髓鞘呈同心圆状或椭圆状规则排列，髓鞘薄厚均匀且轮廓清晰，周围纤维组织增生不明显。髓鞘板层布局紧凑且厚实，无轴突变性或脱髓鞘现象。脱髓鞘、板层分离和纤维结缔组织增生仅在少数有髓轴突中显示。在对照组中，看到极少数正常的有髓轴突。再生髓鞘扭曲变形，厚度不均匀，形状不规则。再生轴突脱髓鞘、板层分离和纤维结缔组织增生较明显。髓鞘板层比实验组薄。统计结果显示，实验组的有髓神经纤维总数、平均轴索直径和髓鞘厚度明显大于对照组（P<0.05）。结论：低剂量X射线照射对大鼠坐骨神经横断后神经再生产生一定的有益效果。其积极作用是显而易见的，特别是在形态学评估方面。这些发现证明低剂量X射线照射可能是治疗周围神经损伤的一种潜在的治疗方法。但其具体机制仍不明确，仍需要进一步的研究，特别是大规模和长期随访，以确认我们的发现。第二部分低剂量X射线照射对大鼠坐骨神经横断损伤后背根神经节microRNA表达的影响背景和目的：周围神经横断损伤是临床上的常见疾病。我们研究发现低剂量X射线照射可以促进大鼠坐骨神经横断损伤后神经再生及功能恢复，但及具体机制仍不明确。MicroRNA（miRNAs）是体内不编码的单链RNA，长度大约在18-22 bp左右，在人体的许多发育，生理和病理的过程中起着重要的作用。是否miRNAs也参与到低剂量X射线照射对大鼠坐骨神经横断损伤后背根神经节的恢复还未见报道。RNA测序（RNA Sequencing， RNA-Seq）是最近兴起的一个高通量核酸测定的方法，能够反映某一组织，细胞或者生理状况下基因的表达水平。本研究的通过检测低剂量X-ray照射后脊髓背根神经节中miRNAs组的表达变化，探索miRNAs参与大鼠周围神经损伤恢复的途径。阐明低剂量X射线照射促进周围神经再生的作用机制，为周围神经横断损伤的有效治疗策略提供实验研究的新思路及技术平台，从而为周围神经损伤的治疗提供帮助。方法：根据前期实验结果，我们发现1 Gy照射组72小时，坐骨神经中VEGF和GAP43的表达达到峰值，由此我们选取这两个组的坐骨神经组织去进行miRNAs测序。样品准备后好，分别进行miRNAs提取，然后进行建库，构建miRNAs转录组文库，采用Illumina HiSeq进行转录组测序，将测序的原始数据进行分析得到clean data，对clean data进行生物信息学分析和鉴定，筛选差异表达基因，运用生物信息分析软件对差异表达基因进行聚类、功能富集情况（Gene Ontology，GO）、KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome）通路和基因网络分析，为了确定miRNAs测序结果，我们选择了几个候选miRNAs对测序结果进行qRT-PCR验证。结果：经过深度测序结果，本研究共鉴定出804个miRNAs。其中327个已知的miRNAs，477是新的miRNAs。相对于对照组在1 Gy照射组差异表达的是150个miRNAs。在这150个差异表达的miRNAs中，149个是新miRNAs。在这些差异表达的miRNAs中，56个表达上调，94个表达下调。生物信息分析预测发现差异表达的150个miRNAs共计靶向23,652个基因和48,157个靶位点。许多参与神经发生、血管发生、凋亡和神经活性配体受体相互作用的基因，如Stat、P13k、Vegfa、Cdk、P21、Casp9、CHRM和Nmur被预测为这些差异表达的miRNAs的靶标。KEGG数据库富集分析使用靶mRNA的差异表达进行。结果表明，KEGG类别富集与癌症、PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用和MAPK信号通路等途径相关。VEGFA是在神经修复的过程中其重要作用的分子，其表达量的升高是神经修复能力的重要指标。在我们差异表达的miRNAs中，我们发现四个差异表达的miRNAs（新型miRNAs-360、-310、-239和-400）为靶向Vegfa，所有候选miRNAs在RNA-seq结果中表达下调。我们的qRT-PCR结果证实了在我们的RNA测序分析中发现的miRNAs表达模式。此外，在Vegfa 3'UTR中鉴定了新型miRNAs-360、-301、-239和-400的靶位点。细胞转染实验发现，这四个新型miRNAs-360、-310、-239和-400能够靶向调节Vegfa表达。结论：miRNAs深度测序研究表明低剂量X-ray照射诱导大鼠坐骨神经损伤后脊髓神经节miRNAs表达变化并且许多新型miRNAs参与周围神经损伤的修复。尽管许多miRNAs被鉴定和低剂量X-ray照射诱导大鼠坐骨神经损伤后恢复相关，但是具体的机制还需要更多的研究。并且这些发现证明低剂量X-ray照射差异表达的miRNAs可能是治疗周围神经损伤的一个潜在的治疗方法。但仍需要进一步的研究。

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作者
江波;
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作者单位

苏州大学;

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授予单位苏州大学;
学科外科学(骨外科学)
授予学位博士
导师姓名董启榕;
年度 2018
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类放射医学;肿瘤学;
关键词
低剂量; 射线照射; 大鼠坐骨神经损伤; 神经再生; 背根神经节; microRNA; 表达;

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