IL-33/ST2在肿瘤微环境中的表达及IL-33对人CD8+T细胞作用的初步探讨

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肿瘤是一个包含有肿瘤细胞、浸润的免疫细胞、间质细胞以及微环境中一系列分子组成的生态系统。肿瘤浸润淋巴细胞的类型、数量及功能决定了机体肿瘤免疫应答的结果，T淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫应答中发挥着极其重要的作用，其中CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）及CD4+I型辅助T细胞（Th1 cells）介导的I型适应性免疫应答是抗肿瘤免疫的基础。
　　肿瘤微环境造成的免疫抑制会使CD4+Th1细胞及CD8+CTLs处于一种无能状态，因此，寻找可以活化肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），逆转其无反应性，改变肿瘤微环境的新的分子和途径，正成为肿瘤免疫治疗的一大热点。
　　IL-33是2005年发现的IL-1家族的第11个成员，其受体是ST2及IL-1受体辅助蛋白组成的二聚体，IL-33被认为是组织损伤及感染的一个预警信号，IL-33/ST2信号途径主要参与Th2型免疫应答、炎症及多种病理过程，而其在抗肿瘤免疫应答中的作用尚不明了。
　　课题组前期研究发现，IL-33协同TCR信号及IL-12可以促进小鼠Tc1细胞IFN-γ的分泌，在小鼠B16黑色素瘤荷瘤模型中，肿瘤微环境表达的IL-33显著提高肿瘤浸润CD8+T细胞IFN-γ的分泌，并且能延缓肿瘤的生长。那么，IL-33及其受体ST2在人肿瘤微环境的表达特征如何？在人类T细胞中，IL-33是否具有同样的促进其效应功能的作用尚待研究。鉴此，本研究首先探讨IL-33及其受体ST2在人非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）肿瘤组织及癌旁组织的表达，继而以人外周血单个核细胞（PBMCs）及CD8+T细胞为研究对象，探讨IL-33对人PBMCs及CD8+T细胞体外增殖、活化、效应的影响，以期为将IL-33作为促进T细胞抗肿瘤免疫应答的重要因子运用于肿瘤过继性细胞免疫治疗提供理论依据。
　　第一部分IL-33/ST2在人非小细胞肺癌肿瘤微环境中的表达
　　【目的】探讨细胞因子IL-33及其受体ST2在人非小细胞肺癌肿瘤微环境中的表达。
　　【方法】收集苏州大学附属第一医院心胸外科手术切除且病理诊断明确的非小细胞肺癌（NSCLC）患者肿瘤组织及癌旁组织，采用实时荧光定量PCR（quantitative Realtime PCR，qRT-PCR）检测肿瘤组织及癌旁组织IL-33 mRNA和ST2 mRNA的表达；经免疫组化染色检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织及癌旁组织的IL-33蛋白的表达；采用消化液消化和机械研磨的方法获取组织来源的单细胞悬液，经淋巴细胞分离液分离获得组织浸润淋巴细胞，经免疫荧光标记和流式细胞仪分析检测ST2在肿瘤浸润T淋巴细胞的表达。
　　【结果】1.与癌旁组织相比，非小细胞肺癌患者肿瘤组织中IL-33 mRNA和ST2 mRNA表达水平显著下降（P<0.0001）；2.免疫组化染色结果分析显示，IL-33蛋白的阳性表达为棕黄色颗粒，定位于细胞胞浆内或胞膜上。非小细胞肺癌患者肿瘤细胞内几乎未见IL-33蛋白的阳性表达，癌旁组织正常肺泡上皮细胞胞浆内可见散在分布的棕黄色阳性颗粒；3.非小细胞肺癌患者肿瘤组织和癌旁组织浸润CD4+T、CD8+T淋巴细胞均表达IL-33的受体ST2。
　　【结论】在非小细胞肺癌肿瘤微环境中可以检测到IL-33/ST2的表达，非小细胞肺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞均表达IL-33的受体ST2。
　　第二部分细胞因子IL-33体外促进人PBMCs和CD8+T细胞的效应功能
　　【目的】探讨IL-33是否能在体外增强人外周血单个核细胞（PBMCs）及CD8+T细胞的效应功能，以期为IL-33信号途径运用于肿瘤细胞免疫治疗的临床转化研究奠定基础。
　　【方法】采集健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs），取PBMCs经CD8 磁珠阳性选择富集CD8+T细胞，体外分别经CD3mAb+CD28mAb+IL-2、CD3mAb+CD28mAb+IL-2+IL-12、CD3mAb+CD28mAb+IL-2+IL-12+IL-33三种不同组合分别刺激培养PBMCs及CD8+T细胞，于72h后收集细胞，经实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组细胞γ干扰素(interferon-gamma,IFN-γ) mRNA、颗粒酶B(Granzyme B,GZ-B) mRNA的表达；用CCK-8法检测各组细胞对人肺腺癌A549细胞的杀伤活性；经免疫荧光标记和流式细胞仪分析各组细胞IFN-γ、PD-1的表达。
　　【结果】1.各组细胞因子刺激的人PBMCs形态无明显差异；2.经Realtime PCR检测，IL-33刺激组的人PBMCs表达IFN-γmRNA、GZ-B mRNA的水平显著升高（P<0.05）；3. IL-33刺激组的人PBMCs对肺腺癌细胞株A549细胞的杀伤能力更强（P<0.05）；4. IL-33刺激组的人PBMCs，其CD3+CD8+T细胞亚群上IFN-γ的表达升高（P<0.05）、PD-1的表达降低（P<0.05）；5.各组细胞因子刺激的纯化的人CD8+T细胞形态无明显差异；6.经Realtime PCR检测，IL-33刺激组的人CD8+T细胞表达IFN-γmRNA、GZ-B mRNA的水平显著升高（P<0.05）；7. IL-33刺激组的人CD8+T细胞对肺腺癌细胞株A549细胞的杀伤能力更强（P<0.05）；8. IL-33刺激组的人CD8+T细胞，其CD3+CD8+T细胞亚群上IFN-γ的表达升高（P<0.05）、PD-1的表达降低（P<0.05）。
　　【结论】IL-33能够增强体外培养的人PBMCs及CD8+T细胞的功能进而促进抗肿瘤免疫应答,可能为肿瘤免疫治疗提供新策略，具有潜在的临床应用价值。

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作者
李晓晨;
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作者单位

苏州大学;

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授予单位苏州大学;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名朱一蓓;
年度 2015
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正文语种中文
中图分类肺肿瘤;
关键词
非小细胞肺癌; 白细胞介素33; CD8+T细胞; 抗肿瘤免疫; 动物模型;

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