全基因组、干细胞相关转录因子甲基化水平及基因突变在髓系恶性肿瘤预后判断中的作用

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第一部分急性髓细胞白血病患者全基因组5-mC水平检测
　　【目的】
　　探讨髓系恶性肿瘤急性髓细胞白血病（acute mye lo id le uke mia，AM L）患者全基因组5-甲基胞嘧啶（5-mC）水平及地西他滨对5-mC的影响，分析与AML患者临床特点的关系及对预后的影响。
　　【方法】
　　以2013年1月至2014年12月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的42例AML（男性22例，女性20例，中位年龄63岁）经地西他滨20mg/（m2·d）×3~5d方案联合化疗治疗的患者为研究对象，分别于地西他滨去甲基化治疗前1天、治疗后1天及治疗后7天采集外周血，采用全基因5-甲基胞嘧啶定量分析法检测外周血中5-mC含量。42例AML患者按病期分为初治组（20例）、复发难治组（10例）、缓解组（12例），其中以缓解组作为阳性对照组，另以13例缺铁性贫血患者作为正常对照组。
　　【结果】
　　（1）正常对照组5-mC含量为0.043±0.018ng，阳性对照组为0.052±0.022ng，两组5-mC含量相当，差异无意义（p＞0.05）；初治组和复发难治组5-mC含量分别为0.160±0.089ng、0.270±0.136 ng，明显高于正常对照组和阳性对照组，并且复发难治组高于初治组（p＜0.05）。
　　（2）地西他滨去甲基化治疗后1天及7天，阳性对照组5-mC含量分别为0.050±0.016ng和0.046±0.009ng，较治疗前无明显变化（p＞0.05）；初治组5-mC含量分别为0.084±0.030ng和0.055±0.028 ng，均较治疗前下降，并且两者差异亦有意义（p＜0.05）；复发难治组5-mC含量分别为0.190±0.127 ng和0.142±0.112 ng，较治疗前降低（p＜0.05），但两者间无明显差异（p＞0.05）。
　　（3）治疗后获CR患者5-mC含量为0.063±0.037，NR患者5-mC含量为0.127±0.105，与正常对照组比较，CR组接近正常，NR组显著高于正常（p＞0.05）。
　　（4）治疗前5-mC水平与患者临床特征，如性别、年龄、FAB分型、原始细胞数、外周血细胞计数（白细胞、血红蛋白、血小板数）无明显相关性（p＞0.05）。
　　（5）治疗前5-mC水平影响AML患者的OS及DFS，5-mC低于中位水平0.113ng的患者较高于0.113ng的患者OS和DFS长。
　　【结论】
　　（1）初治及复发难治的AM L患者全基因组甲基化水平升高。
　　（2）地西他滨去甲基化治疗后全基因组甲基化水平下降，缓解后接近正常。
　　（3）全基因组甲基化水平对AML患者的OS及DFS有影响。
　　第二部分急性髓细胞白血病患者干细胞相关转录因子Sox2、Oct4、Kl f4、C-Myc和Na no g启动子区甲基化状态检测
　　【目的】
　　探讨髓系恶性肿瘤急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）干细胞相关转录因子Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc和Nanog启动子区甲基化状态及地西他滨治疗后甲基化状态改变情况，并分析对预后的影响。
　　【方法】
　　以2013年1月至2014年12月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的42例AML（男性22例，女性20例，中位年龄63岁）均经地西他滨20mg/（m2·d）×3~5d方案联合化疗治疗的患者为研究对像，分别于地西他滨去甲基化治疗前1天及治疗后7天采集外周血，采用甲基化特异性 PCR(methylation-specific PCR，MSP)技术检测患者外周血中 Sox2、Oct4、Klf4、C-myc和 Nanog基因启动子区甲基化状态及去甲基化治疗后改变情况。42例AML患者按病期分为初治组（20例）、复发难治组（10例）、缓解组（12例），其中以缓解组作为阳性对照组，另以13例缺铁性贫血患者作为正常对照组。
　　【结果】
　　（1）正常对照组中仅Sox2和Nanog基因检测到甲基化，阳性率为15.4％和30%；阳性对照组中Sox2、Oct4、Klf4、C-myc和Nanog基因甲基化阳性率分别为50%、50%、41.7%、33.3%和100%，明显高于正常对照组（p＜0.05）。初治及复发难治的30例患者中均检测到Sox2、Oct4、Klf4、C-myc和Nanog基因甲基化，阳性率分别为90%、76.7%、70%、86.7%和100%，除Nanog基因，余基因甲基化阳性率均高于两对照组（p＜0.05）。
　　（2）治疗前初治组Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc和Nanog基因甲基化率分别为85%、75%、70%、80%和100%，复发难治组分别为100%、80%、70%、100%和100%，均高于正常对照组（p＜0.05），但两组甲基化率接近（p＞0.05）。Sox2和 C-Myc基因在初治和复发组中甲基化率高于阳性对照组（p＜0.05），余基因在三组间差异无意义（p＞0.05）。
　　（3）地西他滨去甲基化治疗后，阳性对照组各基因甲基化率无显著变化（p＞0.05）；初治组Sox2、Oct4、Klf4和C-Myc基因甲基化阳性率分别为33.3%、40%、21.4%、45%，与治疗前比差异有意义（p＜0.05）；复发难治组So x2、K lf4和C-Myc基因甲基化阳性率较治疗前降低，分别为33.3%、0%和50%，差异有统计学意义（p＜0.05）。
　　（4）各基因甲基化率与患者性别、年龄、FAB分型、原始细胞计数、血细胞计数无明显相关性（p＞0.05）；存在Sox2或Oct4基因甲基化的患者OS及DFS短于未甲基化者，共存Sox2和Oct4基因甲基化的患者较仅存在一种基因甲基化的患者OS缩短。
　　【结论】
　　（1）AM患者存在干细胞相关转录因子 Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc和 Nanog启动子区甲基化。
　　（2）地西他滨去甲基化治疗后Sox2、Oct4、K lf4和C-Myc甲基化阳性率下降。
　　（3）Sox2和Oct4基因甲基化对预后有重要影响。
　　第三部分骨髓增生异常综合征患者TET2、DNMT3A、ASXL1基因突变研究
　　【目的】
　　探讨髓系恶性肿瘤骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者TET2、DNMT3A和ASXL1基因突变与临床特征的关系及对预后的影响。
　　【方法】
　　釆用基因组扩增直接测序法检测2013年3月至2014年9月于苏州大学附属第二医院血液科就诊的20例MDS患者（男性12例，女性8例，中位年龄66岁）骨髓中TET2（exon3、exon11）、DNMT3A（exon23）、ASXL1（exon12）基因的突变情况，以6例健康供者外周血标本作为正常对照。
　　【结果】
　　（1）正常对照中均未检出TET2、ASXL1、DNMT3A基因突变；20例MDS患者中3例（15%）检测到TET2基因突变，1例纯合突变，2例杂合突变；4例（20%）检测到ASXL1基因突变，2例纯合突变，2例杂合突变；未检测到DNMT3A基因exon23突变。1例存在TET2和ASXL1共突变，1例存在ASXL12处突变。
　　（2）TET2及ASXL1突变在各亚型、染色体核型、危险分层间突变率无差异；突变患者与野生型患者性别、年龄、外周血细胞计数等无明显差异（p>0.05），TET2突变、ASXL1突变对生存时间无显著影响（p＞0.05）。
　　【结论】
　　（1）TET2、ASXL1基因突变在MDS患者中常见（突变率＞10%）。
　　（2）由于本实验病例数尚少，TET2、ASXL1基因突变对生存时间的影响尚不确定。

著录项

作者
张立莹;
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作者单位

苏州大学;

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授予单位苏州大学;
学科内科学(血液病学)
授予学位硕士
导师姓名傅晋翔;
年度 2014
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类急性白血病;
关键词
急性髓细胞白血病; 转录因子; 甲基化水平; 基因突变; 全基因组; 5-mC水平;

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