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人工合成E-选择素对兔颈总动脉瘤壁平滑肌细胞增殖活性的影响及机制探讨

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摘要

第一部分：实验性免颈总动脉瘤模型的建立及模型动脉瘤壁平滑肌细胞的增殖变化
　　 研究背景及目的：蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是威胁生命的主要疾病之一，据统计，75％以上的蛛网膜下腔出血由颅内动脉瘤(intracranial aneurysm，IA)破裂引起。目前，破裂动脉瘤仅限于外科手术夹闭和血管内介入治疗，且具有相当的风险和一定的并发症。因此，探讨颅内动脉瘤形成、发展和破裂的病理机制，特别是对动脉瘤壁是否存在修复的可能性的探讨具有重要意义。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是平滑肌细胞层的重要组成部分。VSMC在正常的生理分化状态下不表现增殖能力，但是当环境改变时VSMC可发生可逆的表型转换，表现为丧失正常成熟细胞的生理功能并获得增殖能力。可见，血管壁平滑肌细胞的生理功能改变是动脉瘤修复的基础。动脉瘤形成过程是一个动脉破坏和修复的可逆过程，修复主要表现为中膜层平滑肌细胞的增殖和迁移。我们用弹性蛋白酶(elastase，EA)滴注法成功诱导出实验动物动脉瘤模型，该方法易重复，成本低，形态及病理特点更接近人体颅内动脉瘤。我们拟通过对模型动脉瘤壁平滑肌细胞增殖活性的研究，探讨颅内动脉瘤壁的修复的可能性。
　　 方法：(1)新西兰大白兔30只，雌雄各半，随机分成4组，A组（对照组），B、C、D、E组为实验组（其中B组为1周组，C组为2周组，D组为3周组，E组为4周组），每组6只，自由摄水和进食，室温20-25℃，独笼饲养，术前禁水禁食12h。(2)游标卡尺测量距右颈内外动脉分叉处近端约0.5cm～1.0cm颈总动脉(commoncarotidartery,CCA)直径，手术显微镜下轻轻剥离该部表面的纤维结缔组织，抽取50μ/ml的弹性蛋白酶0.2ml滴注其表面，对照组用PBS滴注，20min后通过兔耳缘静脉缓慢推注肝素纳500u。(3)1周后行兔颈总动脉系统CT血管造影(CTA)分别观察对照组和实验组兔右颈总动脉滴注部位血管的形态改变和动脉瘤发展情况。(4)按照实验动物分组，从手术日起每隔1周处死一组实验动物，处死前测量动脉瘤的颈宽、瘤高，收集颈总动脉瘤标本（对照组于手术后1周取标本）。(5)对动脉瘤标本进行HE染色和光镜检查。(6)一部分标本进行免疫组化染色，对α-SMA、PCNA、MMP-2蛋白表达情况进行对比研究。(7)对另一部分标本进行实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测OPNmRNA和MMP-2mRNA的表达变化。
　　 结果：(1)影像学检查结果：1周后兔颈总动脉系统CTA检查发现。24只实验兔均发现右侧颈总动脉作用血管段形成明显的梭形或囊状动脉瘤，其中部分可见血栓形成，且有血管闭塞现象，对照组未发现动脉瘤样病变；在兔处死前用游标卡尺测量动脉瘤的颈宽、瘤高。C组分别与B组相比，动脉瘤高度和宽度增大较明显(p＜0.05)，而与D、E组比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。(2)病理检查结果显示：兔颈总动脉瘤壁内膜破坏并逐渐消失，弹性纤维断裂，平滑肌细胞萎缩，平滑肌细胞数目和层数减少。(3)免疫组化检测结果显示：MMP-2实验组与对照组相比表达均有明显增加(p＜0.05)；其中C组表达最高，与B、D、E组相比，差异显著(p＜0.05)：而E组与D组比较，表达下降但差异不明显(p＞0.05)。PCNA实验组与对照组相比表达均有明显增加(p＜0.05)；其中B组表达最高，与C、D、E组相比，差异显著(p＜0.05)；而C、D、E组表达逐渐下降，但差异不明显(p＞0.05)。α-SMA实验组与对照组相比表达均有明显降低(P＞0.05)；其中B、C、D、E组表达逐渐下降，各组间差异均有统计学意义(p＜0.05)。表明，α-SMA在对照组表达最高，实验组表达逐渐降低；PCNA、MMP-2在对照组表达甚微，PCNA表达1周时最高，随后逐渐下降，MMP-2在2周时表达最高。(4)Real-timePCR检测结果显示：：MMP-2实验组与对照组相比表达均有明显增加(p＜0.05)；其中C组表达最高，与B、D、E组相比，差异显著(p＜0.05)；而D组与E组比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。OPN实验组与对照组相比表达均有明显增加(p＜0.05)。对照组表达甚微，实验组表达逐渐升高，B、C、D、E组各组间比较，差异均有统计学意义(p＞0.05)。
　　 结论：(1)弹性蛋白酶滴注诱导法建立的动脉瘤模型，方法简便，易重复，成本低，且效果确切，模型较稳定。此模型在动脉瘤形态、组织病理、形成发展机制上较接近人颅内动脉瘤，既可用于病因和发病机制的研究，也可用于治疗方面的研究，是目前较为理想的动脉瘤模型之一。(2)平滑肌细胞数目和层数的减少在动脉瘤形成过程中起着关键作用，MMP-2分泌的增多是引起平滑肌层改变的重要原因。(3)动脉瘤形成过程中动脉瘤壁平滑肌细胞产生增殖，且VSMC由收缩型向合成型转化以修复变形的动脉瘤壁。
　　 第二部分：人工合成E选择素对兔颈总动脉瘤壁平滑肌细胞增殖活性的影响及机制探讨
　　 研究背景及目的：颅内动脉瘤破裂是引发蛛网膜下腔出血的主要原因，具有极高的致死率和致残率。目前，破裂动脉瘤仅限于外科手术夹闭和血管内介入治疗，对动脉瘤壁的修复研究甚少。但是随着当今生物治疗和基因治疗的发展，对动脉瘤的药物修复等非手术治疗将拥有很大的发展前景。颅内动脉分为内皮层、平滑肌细胞层和外膜层，当发生动脉瘤时，内皮层首先破坏，然后产生内弹力层的断裂和消失，接着是平滑肌细胞的退变与平滑细胞层数的减少，最后是外膜破坏与动脉瘤破裂。在整个动脉瘤形成过程中平滑肌细胞层的退变尤为显著，而且是一个破坏与修复的可逆过程，但由于血流切应力和炎症的影响使得破坏的程度远远大于修复，最终导致动脉瘤破裂。因此，探讨颅内动脉瘤形成过程中平滑肌细胞的增殖活性，将成为动脉瘤壁修复研究的基础。本部分在第一部分利用弹性蛋白酶滴注法诱导实验性兔颈内动脉动脉瘤模型的基础上，应用人工合成E选择素进行干预，以观察炎症和动脉瘤壁平滑肌细胞增殖活性的关系，为颅内动脉瘤壁的修复研究提供依据。
　　 方法：(1)新西兰大白兔24只作为治疗组，雌雄各半，随机分成4组，分别为F、G、H、I组（其中F组为1周组，G组为2周组，H组为3周组，I组为4周组），每组6只，自由进水和摄食，室温20～25℃，独笼饲养，术前禁水禁食12h。(2)与第一部分相同，建立实验性兔颈总动脉瘤模型。(3)将各组兔右侧耳缘静脉埋置24GY型静脉留置针，沿兔耳缘静脉注射人工合成E-选择素2mg/(kg·w)，分别至第1、2、3、4周末处死。(4)1周后行兔颈总动脉系统CTA分别观察治疗组组兔右侧颈总动脉滴注局部血管的形态改变和动脉瘤发展情况。(5)按照实验动物分组，从手术日起每隔1周处死一组实验动物，处死前测量动脉瘤的颈宽、瘤高，收集颈内动脉瘤标本。(6)对标本进行HE染色和光镜检查。(7)对标本进行免疫组化染色，对α-SMA、PCNA和MMP-2蛋白表达情况进行研究。(8)对标本进行进行实时荧光定量PCR（Real-timePCR）检测OPNmRNA和MMP-2mRNA表达情况。
　　 结果：(1)影像学检查和大体测量结果显示：1周后兔颈内动脉系统CTA检查发现，24只治疗组兔右颈总动脉作用血管段均发现有梭形或囊状动脉瘤形成，其中少部分瘤壁有血栓形成，G、H、I组分别与C、D、E组相比，其动脉瘤高度和宽度均有明显减小(p＜0.05)，而F组与B组相比，动脉瘤高度和宽度减小不明显(p＞0.05)。(2)病理检查结果显示：治疗组动脉瘤壁与实验组相比，平滑肌细胞数目和层数减少的程度明显下降，弹性纤维断裂和平滑肌细胞降解的程度亦有减轻。(3)MMP-2治疗组与实验组相比表达均有不同程度减少；其中F组与B组、G组与C组相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)；其余两时间段两组比较，差异不明显(p＞0.05)。PCNAF组与B组、G组与C组相比，表达明显减少(p＜0.05)；而H组和D组相比，表达升高且有统计学意义(p＜0.05)；I组和E组相比，表达升高但不明显(p＞0.05)。α-SMA治疗组与实验组相比表达均有不同程度减少；其中E组与I组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)；其余各时间段两组比较，差异明显(p＜0.05)。(4)PCR检测结果显示：OPN治疗组与实验组相比表达均有不同程度升高；其中E组与I组相比，差异无统计学意义(p＞0.05)；其余各时间段两组比较，差异明显(p＜0.05)。MMP-2治疗组与实验组相比表达均有不同程度减少：其中F组与B组、G组与C组相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)；其余时间段两组比较，差异不明显(p＞0.05)。
　　 结论：(1)人工合成E-选择素可以抑制兔颈总动脉瘤壁平滑肌细胞数目和层数的减少，减轻弹性纤维断裂和平滑肌细胞降解的程度，从而延缓或阻止动脉瘤的发展和破裂。(2)人工合成E-选择素可有效促进兔颈总动脉瘤壁平滑肌细胞的增殖，使VSMC由收缩型向合成型转化，进而对动脉瘤壁起到一定的修复作用。

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