日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ与非结构蛋白NS1的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

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日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，可以引起人的脑炎现分布在于东南亚和太平洋地区大部分国家。猪是JEV最主要的增殖宿主，病毒经蚊-猪-蚊的循环传播。感染JEV的妊娠母猪会出现流产和死胎，公猪发生睾丸炎，直接影响猪群数量的扩大，造成巨大经济损失，因此有必要建立一种快速、敏感、特异的诊断方法。 JEV的囊膜蛋白(E蛋白)结构域Ⅲ(DⅢ)独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样的结构，许多抗原中和表位都集中于这一结构域，可以作为较好的血清学诊断抗原。非结构蛋白NS1是JEV的主要抗原成分之一，可作为诊断抗原可以区分灭活苗免疫和自然感染抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达了JEV DⅢ和NS1，并用表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA检测方法。主要内容如下：参照GenBank发表的JEV SA14-14-2株基因序列，设计针对DⅢ和NSl的引物，RT-PCR．扩增DⅢ和NS1的基因片断，克隆到pMDl8-T载体，再分别插入到原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)的T7启动子下游，建立pET-DⅢ和pET-NS1两个原核表达载体，将载体转入大肠杆菌BL21中诱导表达。Western-blot分析结果表明，表达的融合蛋白能与阳性血清发生特异性反应。表达产物经亲和层析法进行纯化，以其作为抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗，初步建立了针对Dill和NSl抗体的间接ELISA检测方法。对ELISA各种反应条件进行了摸索，确定了最适工作条件，在此条件下两种方法P/N均大于5，DⅢ-ELISA S/P≥0.35判为阳性。DⅢ-ELISA与猪呼吸与繁殖综合征、猪细小病毒病及猪伪狂犬病的标准阳性血清均呈阴性反应，与猪日本脑炎病毒阳性血清呈阳性反应。批间、批内重复性试验结果变异系数均小于7％。用已建立的DⅢ-ELISA方法和微量细胞中和试验检测方法对280份猪血清样品进行平行检测，结果表明，DⅢ-ELISA方法的敏感性和特异性分别达到89.4％和91.8％，符合率达到87.9％。用建立的DⅢ-ELISA检测猪血清409份，检测时P/N均大于5，检出阳性142份。NS1-ELISA的平行检测结果表明与DⅢ-ELISA存在相关。由于血清背景不明，NS1-ELISA阴阳性判定及用来区分灭活苗和自然感染的效果有待进一步研究。

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作者
薛少博;
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作者单位

扬州大学;

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授予单位扬州大学;
学科动物学
授予学位硕士
导师姓名陈义平;
年度 2007
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类猪;
关键词
日本脑炎病毒; 囊膜蛋白结构域Ⅲ; 非结构蛋白NS1; 原核表达; 间接酶联免疫吸附试验;

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