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鼠抗禽网状内皮组织增殖病病毒gp90多抗的研制及gp90在昆虫细胞中的表达

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文献综述　禽网状内皮组织增生症的研究进展

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第一章禽网状内皮组织增殖病病毒gp90在大肠杆菌中的表达及鼠抗REV-gp90多抗的研制将含按正确的阅读框定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷光甘肽-S-转移酶(GST)的下游的gp90基因的重质粒转化进宿主菌BL21中，在37度0.5mMIPTG诱导下，gp90基因以融合蛋白的形式获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，证实gp90基因以融合蛋白的形式得到良好的表达，且其表达的融合蛋白的大小为64KD。将包涵体变性、复性处理以后，回收免疫老鼠，所得多抗可与REV-SNV株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)在免疫荧光实验中起反应。这表明，大肠杆菌BL21表达的SNV株gp90蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。第二章禽网状内皮组织增殖病病毒gp90基因在昆虫细胞中的表达将REV-SNV株gp90基因用EcoRI和Sall从重组原核质粒pGEX-6P-1-gp90双酶切，回收后，亚克隆到载体pFastBac1中，构建转移载体pFastBac1-gp90；转移载体转化DH10Bac感受态大肠杆菌，通过位点特异性转座作用将gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中。在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板上筛选发生转座的白色菌落，提取DNA,获得重组穿梭载体Bacmid-gp90；将重组穿梭载体Bacmid-gp90用脂质体介导转染Sf9昆虫细胞，获得了含有REV-SNV株gp90基因的重组杆状病毒rBac-gp90(rgp90)。重组病毒感染Sf9细胞后，用IFA方法对细胞表达产物进行检测，结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达REV-SNV株的gp90蛋白。禽网状内皮组织增生症病毒(REV)是禽网状内皮组织增生症的病原，属逆转录病毒科的C型病毒。该病毒主要感染火鸡，也能引起鸡、鸭等禽类以淋巴-网状细胞增生为特征的肿瘤性的病理综合征。主要侵害宿主的淋巴细胞或网状内皮细胞，严重影响宿主免疫系统的功能，诱发细胞免疫和体液免疫抑制，降低机体对其它病原或抗原的免疫应答，导致不同程度的继发、二重感染和多重感染，减弱鸡群对各种疫苗的免疫力，加剧某些疾病的临床表现。目前REV在我国的流行越来越严重，在某些鸡场中对REV阳性抗体的检出率高达21.4％-71％，其中出现免疫抑制状态的鸡群对REV抗体的阳性检出率要比正常鸡群高的多。 GP90是REV病毒env基因编码的表面囊膜糖蛋白，是病毒的主要免疫蛋白，含有顺序和构象表位，具有受体结合功能，能诱导感染宿主产生较高水平的保护性抗体。对不同地区不同时间分离的REV全基因组测序表明，env基因序列同源性在92％以上，其不同主要由编码gp90的基因引起，提示gp90可能与病毒的变异、毒力、致病性、致病机理等有关。本研究将含有经EcoRI和SalI双酶切和基因测序鉴定正确的gp90基因的重组质粒pGEX-6P-1-gp90转化进宿主菌BL21中，在37℃0.5mMIPTG诱导下，gp90基因以融合蛋白的形式获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，证实其表达的融合蛋白的大小为64KD,表达形式为包涵体。通过包涵体纯化的方法，将获得的较高纯度的融合蛋白，免疫小白鼠所得多抗可与REV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)在免疫荧光实验中进行反应。这表明，体外大肠杆菌表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。将REV-gp90基因用EcoRI和SalI从重组原核质粒pGEX-6P-1-gp90双酶切，回收后，亚克隆到载体pFASTBAC1中，构建转移载体pFASTBAC1-gp90；转移载体转化DH10Bac感受态大肠杆菌，通过位点特异性转座作用将gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中。在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板上筛选发生转座的白色菌落，提取DNA,获得重组穿梭载体Bacmid-gp90；将重组穿梭载体Bacmid-gp90用脂质体介导转染Sf9昆虫细胞，获得了含有REV-SNV株gp90基因的重组杆状病毒rBac-gp90(rgp90)。重组病毒感染Sf9细胞4天后，以上述方法制得得鼠抗gp90血清，用IFA方法对细胞表达产物进行检测，结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达REV-SNV株的gp90蛋白。这些研究结果为gp90功能研究奠定了基础。

著录项

作者
钟登科;
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作者单位

扬州大学;

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授予单位扬州大学;
学科预防兽医学
授予学位硕士
导师姓名秦爱建,刘岳龙;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类家畜病毒学;
关键词
禽网状内皮组织增殖病病毒; 间接免疫荧光; 昆虫细胞; 大肠杆菌;

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