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摘 要
ABSTRACT
缩略词表（Abbreviations）
第一章 前言1
2.4.5 PMA效果验证结果25
攻读学位期间的研究成果59
1.1乳制品食源性致病菌的研究进展
近年来, 随着我国经济的持续发展、居民人均收入的不断提高以及膳食结构的逐步改善, 我国乳与乳制品的消
1.2 乳制品中的常见致病菌及常规检测技术
图1.1 PCR原理示意图
Figure 1.1 PCR Schematic Diagram
1.3.1 常规PCR技术
1.3.2 多重PCR技术
1.3.3 实时荧光定量PCR技术
1.3.4 环介导等温扩增技术
1.4 核酸交联染料结合PCR技术
1.4.1样品处理时PMA/EMA浓度的优化
1.4.2曝光时间对检测效果的影响
1.4.3菌悬液浓度对核酸交联剂处理样品的效果的影响
1.5 免疫学技术
1971年瑞典学者Engvall和荷兰学者Vanweeman分别提出了酶联免疫技术, 扩大了其应用范
1.5.1 酶联免疫吸附技术
1.5.2 免疫磁珠分离技术
1.6 研究的目的及意义
第二章 PMA-mPCR检测方法的建立及优化
2.1 前言
2.2 实验材料与仪器
2.2.1实验菌株
表2.1 实验菌株及编号
2.2.2 仪器设备
2.2.3 实验试剂的配制
2.3 实验方法
2.3.1 菌株的培养
2.3.2 引物的设计
2.3.3 细菌DNA模板的提取
2.3.4 mPCR反应条件的优化
Table 2.4 The conditions of PCR reaction
2.3.4.2 引物特异性验证
以表2.3中列出的细菌DNA模板，分别进行单重PCR反应，于2.5% EB 琼脂糖凝胶上样孔进行电泳
2.3.4.3 引物浓度的优化
表2.5 引物浓度优化系统
Table 2.5 The system of Primer concentration optim
2.3.5 PMA效果的验证
2.3.6纯培养液中PMA-mPCR体系最低检出限的测定
克罗诺杆菌、沙门菌和蜡样芽孢杆菌过夜培养，实验前取其相应的菌液进行平板计数，取克罗诺杆菌、沙门菌和蜡
2.3.7乳制品加标样本中PMA-mPCR体系最低检出限的测定
从本地超市购买回纯牛奶，核桃花生奶和全麦奶，采用传统国标方法的平板计数法检测三种样本中未检出克罗诺杆
2.4 结果与讨论
2.4.1引物退火温度优化结果
图2.1 cesB的引物退火温度优化 泳道M：2000 bp DNA Marker；泳道1：51.6
Figure 2.1 Optimization of annealing temperature o
图2.2 OmpA 的引物退火温度优化 泳道M：2000 bp DNA Marker；泳道1：51
Figure 2.2 Optimization of annealing temperature o
图2.3 invA引物引物退火温度优化 泳道M：2000 bp DNA Marker；泳道1：51.
Figure 2.3 Optimization of annealing temperature o
2.4.2引物特异性验证结果
以表2.4中列出的细菌基因DNA模板，进行mPCR反应，于2.5% EB 琼脂糖凝胶上样孔进行电泳，
表2.6 引物特异性验证结果
Table 2.6 the results of the Primer specific vali
2.4.3引物浓度优化结果
本研究对cesB、invA、OmpA相应的引物浓度进行的优化，三个体系引物浓度见表2.5，PCR结果
取5 μL PCR产物于2.5% EB 琼脂糖凝胶上样孔进行电泳，电泳条件为180 V、15 min
图2.4引物浓度优化结果
Figure 2.4 Omtization of primer concentration
2.4.4 mPCR体系优化结果
PCR条件优化好的mPCR图见图2.5
2）PCR反应条件：
图5 mPCR结果图 泳道M：2000 bp DNA Marker；泳道1：蜡样芽孢杆菌DNA＋肠炎
Figure 2.5 Results of optimized mPCR Line M：2000
2.4.5 PMA效果验证结果
本研究对经过夜培养的克罗诺杆菌、蜡样芽孢杆菌和肠炎沙门菌进行10倍梯度稀释后结合PMA处理和进行mP
图2.8 肠炎沙门菌最低检测限图 泳道M：2000 bp DNA Marker；泳道1：107 C
Figure 2.8 Limit of detection of S. Enteritidis L
图2.9 蜡样芽孢杆菌最低检测限图 泳道M：2000 bp DNA Marker；泳道1：107
Figure 2.9 Limit of detection of B. cereus Line M
2.4.7 乳制品加标样本中PMA-mPCR体系最低检出限的确定
从本地超市购买回纯牛奶，核桃花生奶和全麦奶，采用传统国标方法的平板计数法检测三种样本中未检出克罗诺杆 (1)
本研究显示，经过短时间富集培养后，该方法对纯牛奶，核桃花生奶和全麦早餐奶中克罗诺杆菌、肠炎沙门菌和蜡
表2.8 不同的培养时间三种菌的检测结果
Table 2.8 Results of Propidium mPCR for Cronobacte
注：表中+表示阳性；-表示阴性。
2.5 小结
第三章 实际样品检测国标方法与PMA-mPCR方法的对比
3.1前言
3.2 国标传统培养法的结果
3.2.1沙门菌的检测
3.2.2蜡样芽孢杆菌的检测
3.2.3克罗诺杆菌的检测
3.2.4 传统国标方法检测的结果
3.3 PMA-mPCR方法检测结果
3.3.2 PCR反应条件：
3.4 小结与讨论
第四章 三重PCR检测试剂盒的设计、组装和应用
4.2试剂盒的组装
图4.1 组装后的试剂盒示意图
Figure 4.1 The picture of m-PCR kit
4.3 重复性试验
4.3.1 批内重复性试验
4.3.2 批间重复性试验
4.4稳定性试验
4.5保存期试验
4.6 试剂盒的应用
4.7 讨论与小结
第五章 结论与展望
5.1结论
5.2 展望
本研究通过建立一种能同时检测乳制品中克罗诺杆菌、沙门菌和蜡样孢杆菌活菌三种食源性致病菌的多重PCR方
致谢
参考文献
附录A1
3）直接取5 μL PCR产物与DL 2000 DNA Marker 5 μL一起上样于2.5% EB琼
结果判定与表述
个人简介
攻读学位期间的研究成果
