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去甲肾上腺素介导的β-肾上腺素能受体活化通过激活ERK1/2/CREB和PI3K/PDK1/AKT信号通路促进肝癌细胞增殖

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第1章 引言

1.1 肝癌研究现状

1.2 肾上腺素能受体的简述

1.3β-肾上腺素能受体与肿瘤的相关性

1.4β-肾上腺素能受体与肿瘤相关的信号通路

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验所用溶液的配制

2.3 实验方法

第3章 结果与分析

3.1β-AR在肝癌细胞和正常肝细胞中的mRNA水平检测

3.2 激活β-AR可以促进肝癌细胞的增殖

3.3 β-AR在 HepG2细胞中激活ERK1/2/CREB信号通路

3.4 在HepG2细胞中抑制ERK1/2和CREB的表达可以明显减弱β-AR的促增殖效应

3.5β-AR在 HepG2细胞中可能激活PI3K/PDK1/AKT信号通路

3 .6 激活β-AR对 He pG2细胞迁移的影响

3 .7 激活β-AR对 He pG2细胞上皮间质转化的影响

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:β-肾上腺素能受体与肿瘤发生的相关性

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摘要

研究背景和研究目的：
　　肝癌是我国最常见、死亡率较高的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年升高及发病年龄提前的趋势。肝癌侵袭性强，术后复发快，死亡率高，未经治疗的生存期不超过10个月。近年来，尽管肝癌的临床研究取得了一定的进展，但与肝癌发生相关的分子机制仍远未阐明。研究发现，β-肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor,β-AR）被激活后可以促进肿瘤的新血管生成、迁移侵袭、上皮间质转化和炎症等许多恶性生物学行为，同时β-AR也可以调控与这些恶性生物学行为相关的多条信号通路。本项目主要研究激活β-AR后促进HepG2细胞增殖的相关信号机制。
　　实验方法：
　　1.肝癌细胞（HepG2）β1-AR、β2-AR基因表达的检测：从肝癌细胞（HepG2）和正常肝细胞（LO2）中提取的总RNA，然后用qPCR或 RT-PCR检测细胞的β1-AR、β2-AR的mRNA表达水平。
　　2.去甲肾上腺素（NE）对HepG2细胞增殖的影响：用浓度分别为0、1、2、5、10、20、30μM的NE刺激HepG2细胞和LO2细胞48h后，用MTT法检测细胞的增殖情况。再用浓度为0、5、10和20μM的N E分别刺激Hep G2细胞24h、48h、72h，用MTT法检测细胞的增殖情况。
　　3. NE对细胞迁移及细胞形态的影响：分别用细胞划痕实验和EMT实验检测激活β-AR对Hep G2细胞迁移和细胞形态的影响。
　　4.NE促进HepG2细胞增殖的机制分析：
　　1）β-AR的特异性抑制剂PRO或ERK1/2的特异性抑制剂U0126对NE诱导HepG2增殖的影响：上述抑制剂处理HepG2细胞30min，然后分别用NE刺激细胞48h，再用MTT法检测细胞的增殖情况；
　　2）CREB特异性siRNA干扰CREB后，用NE刺激HepG2细胞48h，再用MTT法检测细胞的增殖情况；
　　3）各种抑制剂对NE诱导下游信号通路的影响：首先用浓度为10μM的NE分别在0、2、5、10、20、30、60和120 min刺激HepG2细胞，western blot分别检测ERK1/2、CREB、AKT和PDK1的磷酸化情况，并观察各种抑制剂对NE介导的下游靶蛋白磷酸化的影响。
　　实验结果：
　　1.qPCR和RT-PCR结果显示，肝癌细胞（HepG2）β1-AR、β2-AR的mRNA表达水平明显高于LO2细胞。
　　2.NE明显促进 HepG2细胞的增殖，并呈浓度依赖性。NE的最佳浓度为10μM，最佳时间为48h。
　　3.NE对HepG2的细胞迁移和细胞形态无明显影响。
　　4.机制分析：
　　1）β-AR的特异性抑制剂PRO、ERK1/2的特异性抑制剂U0126以及特异性干扰CREB后，均可明显抑制NE促HepG2细胞增殖效应；
　　2）NE（10μM）可显著增加HepG2细胞的ERK1/2、CREB、AKT和PDK1的磷酸化水平；
　　3）β-AR的特异性抑制剂PRO和ERK1/2特异性抑制剂U0126均可明显抑制NE刺激HepG2细胞诱导的ERK1/2和CREB的磷酸化作用。
　　结论：
　　1.肝癌细胞（HepG2）β1-AR和β2-AR的表达水平远高于正常肝细胞（LO2）。
　　2.NE显著促进 HepG2细胞的增殖，但对细胞迁移及细胞形态没有明显影响。
　　3.NE促进HepG2细胞增殖的机制可能与其激活β-AR介导的ERK1/2/CREB信号通路以及PI3K/PDK1/AK T信号通路有关。

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