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自闭症基因表达谱数据meta分析的可视化数据库建立及其候选基因初步验证

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第1章 前言

第2章 自闭症基因表达谱数据meta分析的可视化数据库建立

2.1 概述

2.2 实验数据和方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 可视化数据库筛选候选基因及其验证

3.1 概述

3.2 材料和方法

3.3 结果

3.4讨论

第4章 结论

第5章 不足与展望

5.1 不足

5.2 展望

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间的研究成果

综述:自闭症的组织基因表达谱在其病因中应用发展研究

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摘要

目的：
　　自闭症(autism spectrum disorders，ASD)是一种具有高遗传性、临床异质性和生物复杂性的神经行为障碍类疾病。目前各独立研究之间缺乏一个明确的共识。为此，我们进行了不同来源的脑组织基因表达谱的meta分析，并建立了可视化数据库来共享分析结果。此外，从建立的可视化数据库中对所挑选的感兴趣候选基因进行实验验证。为进一步探索自闭症可能的有关发病机制及其防治提供新思路。
　　方法:
　　（1）可视化数据库建立：本研究对目前所报道人源性 ASD研究中的脑组织基因表达谱（84个男性大脑皮层尸体解剖样本：病例35个，对照49个；18个女性大脑皮层尸体解剖样本：病例12个，对照6个；32个小脑尸体解剖样本：病例13个，对照19个；4个福尔马林固定样本：病例1个，对照3个）和鼠源性ASD模型的脑基因表达谱（80个样本：ASD模型54个，对照26个）进行meta分析。随后采用 R软件编程，建立交互共享的 ASD脑组织基因差异表达meta分析的可视化数据库（database with meta-analysis of differentially expressed genes in Autism Spectrum Disorder，dbMDEGA）。
　　（2）候选基因实验验证：首先从meta分析的可视化数据库中选择P≤10-5，然后通过文献再筛选可能与神经系统功能相关的基因为感兴趣的候选基因，进行实验验证。本研究利用神经生长因子（nerve growth factor，NGF）诱导PC12神经细胞突起过生长作为ASD模型，并在此细胞模型上进行候选基因验证。PC12细胞置于5％CO2、37℃的培养箱中培养，经过50 ng/ml NGF处理，0 ng/ml NGF作为对照，分别在24h、48h、72h、96h和118h时间点，使用鬼比环肽染料进行细胞骨架F-actin染色，荧光显微镜观察细胞突起形态变化，使用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）检测候选基因表达水平。
　　结果：
　　（1）ASD基因表达谱数据meta分析的可视化数据库建立：在目前已报道的自闭症脑组织基因芯片数据库基础上，通过 R语言软件编程，进行 meta分析后，进一步成功建立了备有注释的自闭症脑组织差异表达基因meta分析结果的数据库 dbMDEGA，该数据库具有公开门户网站(https://dbmdega. shinyapps.io/dbMDEGA/)，可被研究者网络可视化使用。在本研究建立的数据库dbMDEGA所呈现用户界面中，显示了不同性别、脑组织状态以及脑组织区域的差异表达基因的 meta分析统计值以及森林图和豆形图。该数据库dbMDEGA能够提供可查询的基于已报道过，并可以更新的自闭症脑组织基因表达谱得到的meta分析结果，有助于发现自闭症潜在的候选基因（本研究结果已投稿under review）。
　　（2）突起过生长的ASD细胞模型建立：利用不同时间和浓度的NGF诱导PC12细胞突起过生长。F-actin染色结果发现，与对照组相比，50 ng/ml NGF处理可以引起 PC12细胞平均突起数目和突起长度增加，且差异有统计学意义（P＜0.01）。此外，NGF处理后的细胞平均突起数目和突起长度也会随着诱导时间增加而增加（P＜0.05）。结果提示突起过生长的ASD细胞模型建立成功。
　　（3）突起过生长的ASD细胞模型中候选基因水平改变：从meta分析可视化数据库中筛选出可能与神经系统功能相关的候选基因包括 regulator of G-protein signaling2(RGS2)、transmembrane protein132A(TMEM132A)、THO complex5(THOC5)及 DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member B1(DNAJB1)基因。RT-PCR检测结果发现，与对照组相比，RGS2基因在50 ng/ml NGF处理96h和118h后表达水平上调（P＜0.05）。TMEM132A基因在50 ng/ml NGF处理96h和118h后表达水平也出现上调（P＜0.05），且TMEM132A基因表达水平随着处理时间增加出现增加趋势，但无统计学差异（ P＞0.05）。而DNAJB1和THOC5基因在不同处理组之间未发现表达水平差异（P＞0.05）。研究结论：
　　（1）首次成功建立了一个可供研究者查询的meta分析结果可视化数据库dbMDEGA，为ASD病因的探索和机制的研究提供有价值的帮助。同时，为其他疾病建立meta分析结果可视化数据库提供了方法参见。
　　（2）成功建立了突起过生长的ASD细胞模型。
　　（3）对通过可视化数据库dbMDEGA，挑选的RGS2、TMEM132A、DNAJB1和THOC5四个候选基因，在突起过生长的ASD细胞模型上进行了检测验证。发现其中的RGS2和TMEM132A基因在细胞模型上出现高表达，这为后期研究RGS2和TMEM132A基因与自闭症病因的关系提供重要的依据。

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