结蛋白病肌纤维内线粒体膜孔通道蛋白1相关蛋白表达异常的观察

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背景与目的：
　　结蛋白基因突变导致的结蛋白病是一种遗传性蛋白聚集性肌病，线粒体异常是结蛋白病最早发生的病理改变之一，然而导致线粒体出现异常的相关机制目前不完全清楚。膜孔通道蛋白1/电压依赖阴离子通道1（VDAC1）是线粒体通透性转化孔（mPTP）的重要调控亚基，当mPTP通透性增高时，大量细胞凋亡因子从线粒体膜间隙释放到胞浆，导致细胞凋亡级联反应。然而结蛋白病与VDAC1是否有明确关系尚无研究明确阐述，本研究通过免疫组化观察结蛋白沉积性肌病患者和结蛋白病动物模型中VDAC1及其相关凋亡蛋白（Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）的表达，探究结蛋白病肌细胞内线粒体异常的可能机制。
　　方法：
　　1.构建腺病毒包装的突变型和野生型结蛋白基因的真核生物表达质粒。
　　2.首次造模：实验组将浓度为1.0×1011pfu/ml包装有突变型结蛋白质粒的腺病毒按九宫格法分九点微量注射到28-35日龄雄性SD大鼠左后大腿肌内，每只大鼠注射总量为100μl。右后大腿对应点注射等量包装有野生型结蛋白基因质粒的腺病毒为对照组。分别于转染后第2、7、14、21、28天各处死2只大鼠，取注射点处的肌肉行肌肉冰冻切片常规染色及desmin免疫组化染色。对比观察出现以结蛋白沉积为主要改变的典型结蛋白病病理改变的转染后天数，以确定造模条件。
　　3.重复造模：根据上述的实验结果，将突变结蛋白基因的腺病毒微量注射4只28-35日龄雄性SD大鼠（方法同上），在已观察到的出现以结蛋白沉积为主要改变的转染后天数取注射区局部肌肉，行冰冻切片desmin免疫组化染色，观察模型的稳定性。
　　4.将造模成功动物模型与结蛋白沉积性肌病患者骨骼肌行常规病理及免疫荧光双标染色，对比观察VDAC1及其相关凋亡蛋白（Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）的表达。
　　结果：
　　1.首次造模发现转染后第14天，2只SD大鼠实验组的转染局部肌肉的肌纤维内均出现结蛋白沉积等典型结蛋白病病理改变；取4只SD大鼠重复造模，在转染后第14天观察到有3只大鼠实验组转染局部肌肉的肌纤维内出现结蛋白沉积等典型结蛋白病病理改变。
　　2.结蛋白沉积性肌病患者与结蛋白病动物模型均在结蛋白沉积的肌纤维内出现VDAC1、促凋亡蛋白（Bax、ATF2）聚集高信号，而抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）无聚集。其中结蛋白沉积性肌病患者的结蛋白沉积肌纤维内Bcl-2、Bcl-xl较正常肌纤维信号无明显变化，HKⅡ较正常信号略低；结蛋白病动物模型的结蛋白沉积肌纤维内Bcl-2较正常信号略低，Bcl-xl、HKⅡ较正常肌纤维信号无明显变化。
　　结论：
　　1.我们以腺病毒包被突变结蛋白基因以直接肌肉注射转染方式成功构建出结蛋白病动物模型，验证模型稳定性高。
　　2.结蛋白病的发生可能与线粒体相关性促凋亡蛋白（Bax、ATF2）的活化，抑制抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）的表达，刺激VDAC1开放、高表达，进而诱导凋亡因子从线粒体膜间隙释放到胞质，导致细胞凋亡级联反应有关。

著录项

作者
朱元昭;
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作者单位

南昌大学;

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授予单位南昌大学;
学科神经病学
授予学位硕士
导师姓名万慧,洪道俊;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类原发性免疫缺陷病;
关键词
结蛋白病; 结蛋白沉积性肌病; 电压依赖阴离子通道 1; 膜孔通道蛋白1; 细胞凋亡;

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