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FSH、hCG对骨髓间充质干细胞悬滴培养形成卵泡样结构和分泌性激素的影响

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摘要

第1章 引言

第2章 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 主要试剂及配置方法

2．1．3 动物

2．2 方法

2．2．1 雌性大鼠骨髓干细胞的分离和体外培养

2．2．2 第二代传代FBMSCs的鉴定

2．2．3 改良悬滴培养

2．2．4 Real Time PCR法测定传代FBMSCs和悬滴转平板培养后对照、RA、FSH、hCG四组FBMSCs的卵泡三类细胞标志表达

2．2．5 免疫荧光细胞化学和Western blot方法测定4组FBMSCs的FSHR、LHR、SCP3及ZP3蛋白质的表达

2．2．6 放射免疫测定悬滴培养后各组培养液的孕酮、睾酮、雌二醇、雄烯二酮浓度

2．3 统计学方法

第3章 结果

3．1 雌性大鼠骨髓间充质干细胞(FBMSCs)鉴定

3．2 悬滴培养的FBMSCs形态学观察

3．3 传代FBMSCs和悬滴转平板培养后的对照组、RA、FSH、hCG组FBMSCs中卵泡膜细胞标志基因的表达情况

3．4 4组FBMSCs的FSHR、LHR、SCP3、ZP3蛋白质的表达情况

3．5 悬滴培养后各组培养液的孕酮、睾酮、雌二酵、雄烯二酮浓度变化

第4章 讨论

4．1 改良悬滴培养的FBMSCs生长特点

4．2 骨髓间充质干细胞可分化为卵母细胞样细胞

4．3 骨髓间充质干细胞可分化为有功能的颗粒细胞样细胞和卵泡膜细胞样细胞

4．4 FSH、HCG对骨髓间充质干细胞分化为卵泡细胞和产生性激素的影响

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 哺乳动物骨髓干细胞与雌性卵泡细胞关系的研究进展

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摘要

目的:
　　本研究采用雌性大鼠骨髓间充质干细胞(female bone marrow mensenchymalstem cells，FBMSCs)悬滴培养再转入平板培养，观察是否能分化为有功能性的卵泡样结构和有否卵母细胞样细胞排出，是否产生性激素，观察影响性腺发育的全反式视黄酸(retinoic acid，RA)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)及人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)对其分化效果有否影响，为骨髓移植后部分女性病人恢复生殖功能及FBMSCs移植治疗卵巢早衰、骨质疏松的机理提供实验依据，为人造卵巢研究奠定基础。
　　方法:
　　全骨髓贴壁法分离成年雌性SD大鼠的骨髓干细胞，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养增殖，传代至第2代，以加入20％胎牛血清的DMEM培养液为基本培液，用悬滴培养3天转平板培养方法，加RA、FSH及hCG诱导分化，倒置显微镜观察细胞的形态学变化，是否出现功能性的卵泡样结构和卵母细胞样细胞排出;放射免疫法(RIA)测定各组培养液的雌二醇、睾酮、孕酮和雄烯二酮浓度变化，分析FBMSCs诱导分化细胞产生雌二醇、睾酮、孕酮和雄烯二酮的能力及对促性腺激素的反应性，判断是否产生有功能的卵泡和卵母细胞样细胞;实时定量PCR方法检测卵母细胞标志物SCP3、ZP3和GDF-9、卵泡膜细胞标志物LHR和P450scc及颗粒细胞标志物FSHR和P450arom等表达，western blot和免疫细胞化学方法检测SCP3、ZP3、LHR和FSHR表达。
　　结果:
　　1、离体培养的第2代雌性大鼠骨髓干细胞，主要表现为大小均一、梭形的贴壁细胞，表达CD44、CD71，不表达CD34、CD45，表明是FBMSCs。
　　2、FBMSCs悬滴培养3天转平板培养，获得能够长期培养不断增殖、分化的细胞团。
　　3、以加入20％胎牛血清的DMEM培养液为基本培液，4周内对照组与加入RA、FSH、hCG处理组的FBMSCs能够增殖、分化并形成细胞团，4周后RA组细胞团和细胞数减少，而FSH、hCG与对照组FBMSCs继续增殖、分化、形成更大细胞团和卵泡样结构，并有卵母细胞样细胞排出(64天)。
　　4、RT-PCR和Real Time PCR结果表明对照组、RA组、FSH组和hCG组FBMSCs均表达Stra8、Oct4、C-kit、Vasa、SCP3、ZP3、GDF-9、FSHR、Follistatin、P450arom、LHR和P450scc;免疫细胞化学结果表明4组FBMSCs均有SCP3、FSHR、LHR、ZP3阳性细胞;Western blot结果表明4组FBMSCs均有SCP3、FSHR、ZP3蛋白质表达，表明FBMSCs能够向卵母细胞样细胞、颗粒细胞样细胞和卵泡膜细胞分化。
　　5、两批次用RIA测定4组培养液中性激素浓度，第一批测0天、悬滴转平板培养后4组1、3、5、7、10、14、18、21、28、37、43天，结果表明雌二醇在21-43天4组都有明显增加，雄烯二酮和睾酮在10-21天、孕酮在5-7天4组都有明显减少，第二批测0天、30、48、64天4组培养液中的性激素浓度，雌二醇在48、64天而雄烯二酮和睾酮在30-64天4组都有明显增加，孕酮无明显变化。
　　结论:
　　悬滴培养转入平板培养的4组FBMSCs均可形成卵泡样结构和有卵母细胞样细胞从中排出，并可合成、分泌性激素，表明FBMSCs可诱导分化为卵母细胞样细胞、颗粒细胞样细胞、卵泡膜细胞，产生有一定功能的卵泡样结构。

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