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【6h】

内皮祖细胞对神经干细胞增殖分化及Notch信号分子表达的影响

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第1章引言

第2章材料与方法

第3章结果

第4章讨论

第5章结论

致谢

参考文献

附录A实验照片

附录B 英文缩略词表

附录C 综述：内皮祖细胞及其治疗缺血性脑血管疾病的研究

攻读学位期间的研究成果：

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摘要

目的和意义： 缺血性脑血管疾病已成为人类致死致残的最主要的原因之一，它主要包括两大病理损害，即局部血循环结构的缺失和神经元的损失。故而血供的再恢复及神经修复是缺血性脑损伤临床治疗的两个关键环节。 传统观念认为，成年哺乳动物中枢神经系统不可能再生，如果出现神经元丢失或缺损则难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。但上世纪90年代，神经新生与神经干细胞(NSCs)的发现改变了脑损害后神经不可修复的传统观念。近年亦发现，各种脑损害如脑缺血、癫痫和脑创伤等能产生各种可溶性细胞损伤信号激活NSCs，通过神经新生，选择性补充脑皮层神经元与神经胶质的丢失。有关NSCs的增殖及分化的调控机制随之成为神经科学的研究热点。现已知NSCs的增殖与分化的作用机制复杂而多样，其中Notch信号通路是调节细胞增殖分化的一条古老的途径，在神经发生过程中，它决定着NSCs是选择继续增殖还是向神经元分化，并与NSCs分化为神经元与胶质细胞的比例密切相关。 随着血管内皮祖细胞(EPCs)参与体内血管新生理论的建立，利用内源性EPCs或移植EPCs促进脑缺血区域血管重建也开始受到关注。研究发现缺血性脑损伤发生时，EPCs可从骨髓动员释放到外周血循环或经人为移植到体内，这些细胞迁移到缺血部位参与缺血组织的血管重建和损伤血管的再内皮化过程，使缺血区域中毛细血管密度上调，脑梗死面积缩小，神经功能改善。值得重视的是，神经发生与脑血管发生具有密切关系，血供的恢复是神经修复的基础，EPCs不仅参与血供的恢复，而且还可促进内源性NSCs迁入缺血脑组织参与修复，提示EPCs移植或NSCs与EPCs共移植治疗脑缺血性中风具有良好前景。但EPCs对NSCs的具体作用及影响还不尽了解。因此应用体外的共培养模型，研究在不同的共培养条件下，例如NSCs分别在SU5416及DAPT作用后与EPCs共培养等，观察骨髓来源的EPCs对NSCs增殖分化的影响及对其Notch信号通路的影响，探讨EPCs调控NSCs增殖分化的分子机制，为EPCs、NSCs移植或两者联合移植治疗缺血性脑损伤等中枢神经系统疾病奠定理论基础。 研究内容和方法： 1.贴壁筛选法分离培养大鼠EPCs，形态学、免疫细胞染色法检测ⅤⅢ因子、FLK-1、CD133、CD34的表达及RT-PCR检测eNOS、ⅤⅢ因子、FLK-1、CD133、Tie-2、CD34的基因表达鉴定EPCs。 2.神经球悬浮法培养小鼠NSCs，免疫细胞染色法检测nestin的表达以鉴定NSCs。 3.建立transwell共培养体系，实验共分为5组：①EPCs与NSCs共培养组(EPcs+NSCs)：实验所用EFCs为原代，NSCs为第3代，共培养时，transwell上层皿为EPCs，下层皿为NSCs；②EPCs与经SU5416处理后的NSCs共培养组[EPCs+(SU5416+NSCs)]：transwell下层皿的NSCs经SU5416(10μM)作用6h后再与上层皿的EPCs共培养；③EPCs与经DAPT处理后的NSCs共培养组[EPCs+(DAPT+NSCs)]：transwell上层皿为EPCs，下层皿为已经DAPT(10μM)作用6h后的NSCs；④经DAPT处理后的NSCs对照组(DAPT+NSCs)：transwell上层皿为混合培养培养基，下层皿为已经DAPT(10μM)作用6h后的NSCs；⑤单纯NSCs对照组(NSCs)：transwell上层皿为混合培养培养基，下层皿为NSCs。 4.采用RT—PCR方法观察各培养组共培养2h、6h、12h后notch信号通路相关基因notch1、Hes1、mash1以及NSCs增殖分化相关基因ki67、神经巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白(β-Tubulin)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)的基因表达的变化。 结果： 1.EPCs呈典型的“鹅卵石”排列生长，并经细胞化学染色结果显示ⅤⅢ因子、CD34、FLK-1和CD133阳性，RT—PCR检测有eNOS、ⅤⅢ因子、CD34、FLK—1、CD133和Tie-2的基因表达，符合EPCs特征。 2.成球悬浮法培养的小鼠NSCs增殖旺盛，nestin呈阳性表达。 3.各共培养组NSCs增殖分化相关基因及notch信号通路相关基因的变化 (1)EPCs可促进NSCs的ki67及nestin基因表达。(EPcs+NSCs)组与[EPCs+(SU5416+NSCs)]组比较，ki67及nestin基因表达明显上调，说明EPCs可以促进NSCs的ki67、nestin基因表达且与EPCs分泌的内皮生长因子有关。 (2)EPCs使NSCs的β-Tubulin基因表达上调，同时GFAP基因表达下降。(EPCs+NSCs)组、[EPCs+(SU5416+NSCs)]组及[EPCs+(DAPT+NSCs)]组的NSCs的向神经元分化相关基因β-Tubulin表达均不同程度上调，同时向胶质细胞分化相关基因GFAP基因下调。其中尤以(EPCs+NSCs)明显，说明EPCs可以促进NSCs向神经元方向转化，并与Notch信号通路的调节及内皮生长因子有关。 (3)(EPCs+NSCs)组及[EPCs+(SU5416+NSCs)]组NSCs的hes1基因较其他组表达下调，而mashl基因表达上调。 结论： EPCs可以促进NSCs的增殖及其向神经元方向的分化，这种作用与EPCs对NSCs的Notch信号通路相关基因的调节以及EPCs的内皮生长因子密切相关。

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