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1.黄曲霉毒素B胶体金免疫层析快速检测方法的研究;2.应用噬菌体展示肽库淘选黄曲霉毒素B模拟表位

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第一章黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析方法的研究

第二章应用噬菌体展示肽库淘选黄曲霉毒素B1模拟表位

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摘要

黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AF)是真菌的次级代谢产物，主要由黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉产生，广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农产品中。因AF具有强烈的毒性和致癌性，1993年AF被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。AF是一类结构类似化合物，已经分离鉴定出黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，简称AFB1)、B2、G1、G2、M1、M2等二十余种，其中以AFB1毒性最强。为了防止AFB1含量超标的农产品进入人类食物链，许多国家已经制定了农产品中AFB1的限量标准。因此，建立一种快速检测AFB1的方法具有重要意义。 本论文研究的内容主要包括以下两个方面： 1、AFB1胶体金免疫层析快速检测方法的研究 (1)利用辛酸-硫酸铵盐析法纯化小鼠腹水中抗AFB1单克隆抗体，分别采取间接非竞争ELISA和SDS-PAGE对纯化后抗体的活性和纯度进行鉴定。结果显示抗体和腹水效价分别为1∶1.0×106和1∶2.0×106，SDS-PAGE图谱显示两条带，分别为抗体的重链和轻链。 (2)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。胶体金标记抗体经纯化后，使用XYZ3000点喷平台系统将金标抗体喷在玻璃纤维膜上；将AFB1-BSA(检测线)和驴抗鼠IgG(质控线)分别喷在硝酸纤维素膜(Nitrocellulosemembrane，NCM)上，检测线和质控线两者之间相距4mm。干燥后依次将NCM、玻璃纤维(胶金垫)、样本垫、滤纸、吸水纸粘贴在胶板上，使用BiodotCM4000切刀切成4mm×55mm的试纸条，装入检测卡中密封保存。 (3)通过单因素实验确定了试纸条的工艺参数，具体如下：胶体金粒径为40nm，胶体金标记抗体量为0.5μg/mL,胶体金标记抗体纯化后稀释至OD值为6.0，NCM型号为CN140，NCM上包被AFB1-BSA和驴抗鼠IgG的浓度分别为0.3mg/mL、0.5mg/mL。 (4)由上述条件组装的AFB1试纸条最低检测限为5ng/mL，与赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、桔霉素、展青霉毒素无交叉反应，重复性为98％。根据试纸条行业经验推算，试纸条在4℃可保存15个月。 (5)分别用AFB1试纸条和ELISA方法检测11份样品中AFB1的含量，用甲醇-水(80：20，含0.4％氯化钠)提取，离心后取上清。用0.01MPBS稀释上清液，使甲醇含量为30％，即为试纸条和ELISA的样品测定液。通过试纸条检测，11份样品中仅3号花生和4号花生样品呈阳性，其它样品均为阴性。经ELISA测定，3号花生和4号花生样品中AFB1含量分别60.92ng/mL和7.40ng/mL(此测定值指样品测定液中AFB1的含量)，其它样品中AFB1含量均低于5ng/mL，两种方法的检测结果一致。 2、采用噬菌体随机展示肽库淘选AFB1模拟表位 (1)以抗AFB1单克隆抗体为靶分子，从噬菌体随机7肽库中进行4轮亲和淘选。从第4轮噬菌平板上随机挑选18个噬菌斑，经间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定，获得了15个能与抗AFB1单克隆抗体结合的阳性噬菌体克隆，其中5个能被黄曲霉毒素B1抑制，分别为phage3(P3)、P10、P11、P13和P17。 (2)提取上述5个噬菌体的DNA，进行测序。根据噬菌体文库简要遗传密码将插入的DNA序列翻译成氨基酸序列。结果显示P3和P10为同一序列，并与P11、P13、P17展现出His-X-X-Asp-Pro-X-His(HXXDPXH)共有序列，其中X为任意氨基酸。 (3)用上述5个噬菌体替代AFB1-BSA抗原分别建立间接竞争ELISA标准曲线，结果显示P10竞争曲线最好，其线性范围为500～2000pg/mL，IC50为900pg/mL，检测下限为50pg/mL。 (4)用P10替代AFB1-BSA建立ELISA分析方法，进行样品加标回收实验，回收率在67.5％～72.1％之间。用此方法检测了16份样品中AFB1的含量，结果显示仅有1份花生样品中AFB1的含量超过我国规定的限量标准20μg/kg。

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