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解磷菌和相思根瘤菌高密度培养研究及相思根瘤菌16S rDNA序列分析

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第一章文献综述

1根瘤菌研究进展

1.1根瘤菌与豆科植物共生固氮的研究现状及展望

1.2根瘤菌的分类及其系统发育研究进展

2解磷菌研究进展

2.1磷元素的重要性及有效磷缺乏的问题

2.2解磷菌研究的意义

2.3解磷菌的种群结构

2.4解磷细菌的分离筛选和培养

2.5解磷菌解磷效果的研究

2.6解磷菌对作物生长的影响

2.7解磷菌的研究前景

3高密度发酵培养条件研究

3.1培养基及其培养基的优化

3.2最初pH值

3.3溶氧浓度

3.4接种量

3.5发酵方式的选择和其它影响因素

4本研究的目的

参考文献

第二章相思根瘤菌和解磷菌发酵培养基的优化研究

1前言

2材料与方法

2.1供试菌种

2.2培养基

2.3主要仪器和试剂

2.4菌种活化

2.5发酵培养

2.6不同培养基的比较

2.7培养基的优化

2.8菌株在不同培养基中的生长曲线

3结果与分析

3.1不同培养基对菌株生长的影响

3.2培养基优化

4小结

5讨论

参考文献

第三章相思根瘤菌和解磷菌摇瓶高密度发酵条件的研究

1前言

2材料与方法

2.1菌种和培养基

2.2菌种活化和培养方法

2.3主要仪器和试剂

2.4相思根瘤菌和解磷菌摇瓶高密度发酵条件的研究

2.5发酵结果分析方法

3结果与分析

3.1根瘤菌固氮酶活性相关系数的确定

3.2解磷菌磷标准曲线的绘制

3.3相思根瘤菌和解磷菌摇瓶高密度发酵条件的研究

3.4优化条件下根瘤菌固氮酶活性的测定

3.5优化条件下解磷菌固体解磷能力测定

3.6优化条件下解磷菌pH值、菌数以及解磷能力动态测定

4小结

5讨论

参考文献

第四章相思根瘤菌和解磷菌剂型的初探

1前言

2材料与方法

2.1菌种和培养基

2.2固体菌剂载体

2.3菌种活化和发酵培养方法

2.4固体菌剂的制作

2.5固体菌剂的计数

3结果与分析

3.1供试剂型的活菌数测定结果

3.2固体剂型存活率的测定

4小结

参考文献

第五章相思根瘤菌16S rDNA序列测定及分析

1前言

2材料与方法

2.1供试菌种和培养基

2.2菌种活化和培养方法

2.3主要仪器与试剂

2.4试验方法

3结果与分析

3.1相思根瘤菌基因组总DNA提取

3.2引物的选择

3.3 PCR反应优化结果

3.4相思根瘤菌16S rDNA序列测定结果

3.5相思根瘤菌16S rDNA全序列的相似性比较及系统发育

4小结

5讨论

参考文献

致谢

本人简介

附录:试验中所用培养基配方

附图

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摘要

本课题着重研究了相思根瘤菌及与它相关的解磷菌优化培养条件,该研究结果为研制具有固氮、解磷功能的微生物肥料提供了条件和基础。同时本课题对相思根瘤菌三个菌株进行了16SrDNA基因序列测定与分析,以确定它们与其它根瘤菌的亲缘关系。 1).绘制了相思根瘤菌AJ018、YM2和MZ菌株和解磷菌217菌株在4种培养基中的OD值生长曲线,结果表明:它们都能在BSE培养基中较好的生长;应用正交实验L9(34)对AJ018、YM2和MZ根瘤菌和217解磷菌的常规培养进行优化,获得了它们的优化培养基,进一步绘制的生长曲线证明了优化培养基更利于菌株的生长,且活菌数更多。 2).通过对相思根瘤菌和解磷菌摇瓶发酵中种子菌龄、接种量、装液量、初始pH值和摇床转速等工艺条件的研究,确定出摇瓶发酵的最优培养条件。同时217解磷能力的研究也表明:菌体数量与pH值、解磷强度之间有着密切的关系。另外用乙炔还原法测得它们的最高固氮酶活性表明:在AJ018、MZ和YM2三株菌株中,MZ菌株的固氮能力最好,其固氮酶活性最高可达0.963μg.mL-1.d-1;YM2的固氮能力最差,其最高固氮酶活性仅为0.280μg.mL-1.d-1。 3).制作了相思根瘤菌MZ和217解磷菌8种固体载体的固体剂型,并比较其在贮藏过程中的活菌数和存活率。结果表明相思根瘤菌MZ在这8种固体载体保存效果较差,保存效果最好的是轻质碳酸钙,其活菌数和存活率分别为1.38×105和10.1%。而217解磷菌的8种固体载体保存效果较好,特别是高岭土、微细胞滑石粉和轻质碳酸钙,但高岭土要优于微细胞滑石粉和轻质碳酸钙。 4).测定了相思根瘤菌的16SrDNA序列,将此序列与根瘤菌各已知种及相关种的16SrDNA序列进行了比较,得到了系统发育树状图。在系统发育树状图中,AJ018、MZ菌株与慢生大豆根瘤菌(B.japonicum)、弗氏中华根瘤菌(B.liaoningense)、埃尔坎慢生根瘤菌(B.elkanii)亲缘关系较近,共同构成中华根瘤菌属(Bradyrhizobium)发育分支,在该分支内AJ018菌株与B.japonicum和B.liaoningense的模式菌株16SrDNA相似性分别为95.1%、96.1%,均大于95%;MZ菌株与B.elkanii的模式菌株16SrDNA相似性为98%。因此,分离自相思根瘤菌的AJ018和MZ菌株应该属于Bradyrhizobium属的一个种,但YM2与所有已知根瘤菌属的亲缘关系较远,这是值得进一步研究的菌株。

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