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利用染色体不同整合位点构建具有木糖代谢能力的重组酿酒酵母菌株

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石油资源短缺及石油基产品，特别是以汽油和柴油为代表的车用燃料大量消费导致的大气污染，使发展生物燃料成为共识。燃料乙醇是目前产量最大的生物燃料，国内外主要以糖质和淀粉质原料生产，无法向更大规模发展，因此开发利用木质纤维素类生物质资源生产燃料乙醇成为当前研究的热点，但这类生物质水解产生五碳糖的有效利用是木质纤维素乙醇发酵技术开发的瓶颈之一。
　　木糖是水解液中含量最高的五碳糖，本论文着眼于重组酿酒酵母木糖利用的研究，将毕赤酵母（Scheffersomyces stipites）来源的木糖还原酶（PsXR）基因、木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）来源的木酮糖激酶(ScXK)基因和絮凝基因FLO1以不同组合方式、不同位点整合于工业酿酒酵母菌株染色体上，并利用蛋白质工程手段获得定点突变的PsXR基因，成功将其辅因子倾向性由NADPH改变为NADH，重点研究对木糖利用性能的影响。研究工作构建了8株重组酵母菌株，包括2株絮凝菌株，分别从关键酶基因转录、酶活和混合糖发酵性能等方面对其进行评价，主要研究结果如下:
　　1.在染色体串联整合方式中，PsXR、PsXDH和ScXK基因整合在工业酿酒酵母S.cerevisiae6525第16条染色体的YPRCdelta15位点，构建得到的菌株分别为ZQ1（携带野生型PsXR基因）和ZQ2（携带突变型PsXR基因）。在染色体分散整合方式中，PsXR基因整合于酵母第16条染色体的YPRCdelta15位点，PsXDH基因整合于酵母第16条染色体的YPRCtau3位点，ScXK基因整合于酵母第4条染色体的YIRCdelta6位点，构建得到的菌株分别为ZQ3（携带野生型PsXR基因）和ZQ4（携带突变型PsXR基因）。PsXR、PsXDH基因使用组成型强启动子PGK1p，而ScXK基因则使用中等强度表达的启动子ADH1p，三个基因均采用CYC1t作为终止子。
　　2.为了比较重组酵母ZQ1、ZQ2、ZQ3和ZQ4的木糖代谢能力，分别从木糖代谢基因转录、酶活性、混合糖发酵性能等方面对其进行评价。携带经过突变PsXR基因的ZQ2和ZQ4在发酵周期内可以消耗完所有的木糖，消耗速率都是0.0035 g/g CDW/h，高于携带野生型PsXR基因的ZQ1和ZQ3。ZQ1的木糖消耗速率是0.0022 g/g CDW/h，而ZQ3的木糖消耗速率则与ZQ2、ZQ4的接近，大概在0.0033 g/g CDW/h。ZQ4产生的木糖醇比ZQ2降低了59％，ZQ3木糖醇产量为0.83 g/g，ZQ1在没有消耗完全部木糖的情况下仍然产生0.9 g/g的木糖醇。从两种不同染色体整合方式的比较来看，携带有分散整合方式的重组菌株ZQ3和ZQ4的木糖代谢能力要高于携带串联整合方式的重组菌株ZQ1、ZQ2，而且PsXR基因的辅因子改造有助于降低木糖醇的产生，同时提高木糖的代谢能力。
　　3.将含有PsXR、PsXDH和ScXK三个基因的串联表达整合载体导入不同背景的工业酿酒酵母菌株中，检测出发菌株遗传背景对木糖代谢能力的影响。构建了重组酿酒酵母菌株ZQ1、ZQ5和ZQ7，分别来自工业酿酒酵母S.cerevisiae6525、4126和6508。从木糖代谢基因转录、酶活和混合糖发酵性能等方面对三株重组菌株进行评价，发现ZQ5的三个木糖代谢基因具有最高的转录活性，分别为ZQ1中PsXR酶活的4.1倍，PsXDH酶活的6.2倍，ScXK酶活的4.3倍;为ZQ7中PsXR、PsXDH、ScXK酶活的3.6倍、4.6倍、2.7倍。同时重组菌株ZQ5也是三株菌株中混合糖发酵能力最强的，在不同混合糖浓度条件下都可以完全消耗培养基中的木糖。ZQ1的混合糖发酵能力最弱，在40 g/L葡萄糖和20 g/L木糖浓度下，ZQ7的发酵能力优于其余两株菌株，在第4天可以消耗80％的木糖，而ZQ5只消耗了70％的木糖。实验结果证实不同宿主的遗传背景对重组菌株代谢木糖的能力影响很大，说明重组木糖代谢途径属于宿主依赖性。在构建重组木糖代谢途径时，选择优良的宿主有利于改善木糖发酵效果。
　　4.为了提高重组酵母的胁迫耐受性，将FLO1基因整合在重组菌株ZQ7的不同位点（PHO13位点和 HO位点），构建得到具有絮凝能力的重组菌株ZQ8和ZQ9。将ZQ8和ZQ9培养在液体YPD中，或者是含有乙酸和乙醇等抑制剂的平板上培养，点板结果显示尽管重组菌株ZQ8的絮凝能力高于重组菌株ZQ9，但在乙酸和乙醇条件下的耐受能力明显弱于后者。初步实验证实，FLO1基因整合于 HO位点或者PHO13位点所产生的位置效应是重组菌株耐受性和絮凝能力变化的原因。

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