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肠道菌群失衡对小鼠恶黑肿瘤发生率的影响及益生菌对肿瘤发生的抑制作用

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摘要

前言

材料和方法

1．材料

1．1 实验动物

1．2 B16黑色素瘤细胞株

1．3 细胞培养器材及试剂

1．4 质粒与菌种

1．5 主要实验仪器及设备

1．6 主要实验试剂

1．7 主要实验试剂及溶液配制

2．方法

2．1 B16黑色素瘤细胞培养

2．2 C57BL／6小鼠模型的建立

2．3 动物模型肠道菌群分析

2．4 小鼠结肠HE切片

2．5 免疫组织化学

2．6 统计学分析

结果

3．实验结果

3．1 小鼠黑色素瘤成瘤情况及成瘤率

3．2 利用PCR技术对肠道菌群16S rRNA基因进行扩增

3．3 PCR-DGGE

3．4 小鼠结肠组织HE染色切片

3．5 小鼠免疫组织化学

讨论

结论

参考文献

肠道菌群失衡引起各类疾病的研究进展

致谢

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摘要

抗生素，可以帮助人类有效地杀灭很多对威胁人类及动物生命安全的细菌、病毒、真菌等。然而，不科学地使用抗生素，非但不会帮助人类解决难题，有时甚至适得起反，引发神经毒性、肝肾毒性、肠道菌群失调等一系列的健康问题[1]。研究表明，肠道菌群失调会对人体健康造成各种有害的影响。肠道菌群在正常的条件下，组成了人体肠道的生物学屏障，可以有效抵抗外来的有毒有害物质，并在人体中发挥着免疫调节作用。当人体长期使用抗生素后，会出现肠道缺乏维生素，菌群失衡等问题，进而使肠道菌群无法继续完成免疫防御的作用，造成人体免疫力下降。而健康膳食及微生态制剂，包括酸奶，合生元等，其中所含有的乳酸杆菌、双歧杆菌嗜酸乳杆菌等有益菌可以提高人体免疫力。然而，如何提供一个直接证据，证明抗生素能够降低免疫力，益生菌提高免疫力，将有利于将机制研究引向深入。基于此种想法，本课题拟探索抗生素和益生菌对肠道菌群的影响，进而通过肿瘤发病率反映出它们对免疫力的影响。
　　目的:建立小鼠恶黑肿瘤发病率的客观指标，以发病率的高低显示肠道菌群紊乱对肿瘤发生的促进作用，以及证明益生菌通过修复肠道菌群来抑制肿瘤的发生，为健康的肠道菌群能够提高免疫力、抑制肿瘤发生的观点提供直接证据。
　　方法:左氧氟沙星，属于喹诺酮类别的抗生素，具有较强的广谱抗菌作用。本实验采用该抗生素给C57BL/6小鼠口服灌胃，构建一个抗生素引起的小鼠肠道菌群失衡模型。为建立小鼠肿瘤模型，向小鼠皮下注射恶黑肿瘤细胞，确定能产生实体瘤的最低肿瘤细胞数量，此细胞数即为能否诱导瘤发生的阈值。当移植的肿瘤细胞数量低于该阈值时，如果产生了实体瘤，显示免疫力水平低下。分别取对照组、抗生素处理组、抗生素处理后自我恢复组、益生菌恢复组小鼠的粪便，提取粪便细菌的总DNA，用PCR技术扩增细菌的16S rRNA，运用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)技术检测小鼠的肠道菌群在服用抗生素及益生菌成立后菌群的改变情况。为了确定发生改变的细菌种属，对改变的细菌16S rRNA片段进行克隆和测序，通过数据库比对确定这些发生改变的细菌的种属。在此基础上对小鼠的结肠组织进行解剖并制备石蜡切片，观察小鼠的肠道在内部形态学上是否有所改变，以及各组小鼠肠道粘膜表面的抗体表达的差异，以此来推测抗生素和益生菌影响小鼠免疫功能的机制。
　　结果:服用抗生素之后的小鼠，以及服用过抗生素之后进行自我恢复的小鼠，当注射过肿瘤细胞之后，分别生长出肿瘤，肿瘤的长出率分别为83.33％和33.33％。而在服用过抗生素后继续服用益生菌的小鼠则没有生长出肿瘤。四组小鼠的肠道形态学检测均表现出变化。四组小鼠的结肠粘膜表面NFKB，IL-6和STAT-3的表达均具有统计学差异。NFKB在益生菌组小鼠中表达低于另外三组;IL-6和STAT-3在抗生素组小鼠中的表达高于对照组。(p＜0.05)
　　结论:口服抗生素导致小鼠免疫力下降，小鼠自身的免疫能力可以逐步地修复，而益生菌会对抗生素造成的免疫力低下具有比较好的修复作用。

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