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利用iTRAQ技术筛查神经管畸形产前诊断的分子标志物及其在畸形发生过程中作用机制研究

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论文一 神经管畸形孕鼠血清差异蛋白质筛选

前言

材料与方法

实验结果

讨论

论文二 神经管畸形血清潜在标志物在神经管畸形中的产前诊断价值和在不同胚胎发育期羊水脊髓、胎盘组织中的时空表达规律

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

研究创新性的自我评价

参考文献

综述 蛋白质组学在神经系统疾病的研究应用

在学期间科研成绩

致谢

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摘要

目的：
　　神经管畸形(neural tube defects，NTDs)是儿童常见的畸形，在中国的发病率较西方国家高，发病率为1‰-5‰[1]。该病由环境因素和遗传因素共同作用所致[2]，其畸形的发病机制并不清楚，治疗效果不佳。虽然口服叶酸可以降低50-70％的发病率，但目前仍然没有完全预防和治愈的方法[3]。70-80％的神经管畸形可能通过产前筛查手段如超声及孕妇血清AFP筛查出来[4]，但目前AFP等产前检查标记物的特异性并不高[5]。因此，特异的标志物的发现可以提高产前诊断，并为神经管的早期治疗提供线索。
　　孕期胎儿和孕妇之间存在相互交换，其交换物质包括细胞内、细胞外因子如激素，生长因子和粘附分子，免疫调节因子等[6-8]。母体的生理过程适应胎儿的生长发育，胎儿作为内分泌器官产生大量的蛋白质进入母体和胎儿循环[9，10]。正常妊娠期，在母体循环中可以发现大量的母体和胎儿产生的物质。因此母体胎儿循环标志物的识别有助于产前诊断或预后的标志物发现，并帮助更好的了解潜在的发病机制[11-13]。病理情况下孕早期循环标志物可以在临床症状发展之前作为潜在的诊断标志物，而孕后期标志物的检测可能与疾病的真正表型紧密相关。孕妇血清生化组成成分随怀孕周期不断变化，血清蛋白谱变化能够反应孕妇和胎儿的生理和病理变化。因此研究孕妇血清蛋白谱变化规律对畸形早期发现和研究畸形发生机制具有十分重要的意义。
　　本研究应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(E10)给药，建立脊柱裂大鼠模型，应用蛋白质组学iTRAQ/质谱分析方法，比较致畸早期孕11、13天正常组孕鼠和显性脊柱裂孕鼠血清蛋白表达谱的变化，并采用ELISA方法、real-timeRT-PCR方法、Western-blot方法、免疫组化方法，在基因水平和蛋白水平观察在不同胚胎发育期脊柱裂组和对照组孕鼠血清、羊水、胎盘、胚胎脊髓中差异蛋白质LIFR、PCSK9的表达情况，揭示LIFR、PCSK9在不同胚胎发育期的时空表达规律，以探讨其在脊柱裂发生过程中的作用，为阐明脊柱裂的发病机制提供理论依据。并在神经管畸形及正常孕妇中检测不同孕周PCSK9的变化，以筛查神经管畸形相关血清标记物。
　　方法：
　　一、动物模型建立与标本收集
　　成熟未孕Wistar大鼠，雌雄比例5∶1午夜合笼，晨8-9时阴道涂片，显微镜下见到精子记为E0，E10时维甲酸致畸组以140mg/kg用量经胃管注入;对照组给予同体积的橄榄油。分别于E11、E12、E13、E15、E17心脏穿刺取血，剖宫取出胎鼠，解剖显微镜下辨认畸形类型。血标本用无抗凝剂的5ml普通采血试管，室温放置2h，使血液凝固析出血清，3000g离心20min，分装，-80℃保存。新鲜的羊水，12000 g离心15分钟，4℃，以去除羊水中不可溶的杂质，分装，-80℃储存。取出胎鼠脊髓、胎盘，-80℃保存或4％多聚甲醛固定。
　　NTD孕妇血清及正常孕妇血清、NTD胎儿及正常胎儿组织样本采集自中国医科大学附属盛京医院及沈阳市妇女儿童保健中心，各样本入组均按孕周、孕妇年龄、收集时间匹配。NTD胎儿均经由超声诊断。
　　二、iTRAQ分析
　　（一）样品的制备
　　每个样品精确取出100μ g蛋白。按蛋白∶酶=20∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解4h。按上述比例再补加Trypsin一次，37℃继续酶解8h。
　　（二）iTRAQ标记
　　胰蛋白酶消化后，用真空离心泵抽干肽段。用0.5M TEAB复溶肽段，按照手册进行iTRAQ标记，室温培养2小时。将标记后的各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。
　　（三）SCX分离
　　采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4.6×250mm型号的UltremexSCX柱对样品进行液相分离。将标记后抽干的混合肽段用4ml buffer A(25mM NaH2PO4 in25％ACN，pH2.7)复溶。进柱后以1 ml/min的速率进行梯度洗脱:先在5％ buffer B(25mM NaH2PO4，1M KCl in25％ACN，pH2.7)中洗脱7min，紧跟着一个20min的直线梯度使buffer B由5％上升至60％，最后在2min内使buffer B的比例上升至100％并保持1min，然后恢复到5％平衡10min。整个洗脱过程在214nm吸光度下进行监测，经过筛选得到12个组分。每个组分分别用StrataX除盐柱除盐，然后冷冻抽干。
　　（四）基于Triple TOF5600的LC-ESI-MSMS分析
　　将抽干的每个组分分别用buffer A(5％ ACN，0.1％FA)复溶至约0.5μg/μl的浓度，20000g离心10min，除去不溶物质。每个组分上样5μl（约2.5μ g蛋白），通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行分离。所用的柱子柱包括Trap柱和分析柱两部分。分离程序如下：先以8μl/min的流速在4min内将样品loading到Trap柱上，紧接着一个总流速为300nl/min的分析梯度将样品带入分析柱，分离并传输至质谱系统。先在5％buffer B(95％ACN，0.1％FA)下洗脱5min，跟着一个35min的线性梯度使buffer B的比例由5％上升至35％，在接下来的5min内提高到60％，然后在2min内buffer B增加到80％并保持2min，最后在1min内恢复至5％并在此条件下平衡10min。
　　（五）数据分析
　　质谱分析结果使用和Mascot(version2.3.02)数据查询软件。在大鼠数据库IPI_rat_v3.87（共39925条序列）中查询，本项目鉴定过程中，各参数选择如下：变量修饰为Gln-＞pyro-Glu(N-term Q)，Oxidation(M)，iTRAQ8plex(Y)，固定修饰为Carbamidomethyl(C)，iTRAQ8plex(N-term)，iTRAQ8plex(K)，允许一个胰酶漏切点(trypsin miscleavage)，基于数据库搜索策略的肽段匹配误差控制在0.05Da以下，碎片质量误差±0.1Da。对鉴定的肽段置信度大于95％，significance scores(≥20)。定量分析时，鉴定的蛋白需要包含至少两个不同的肽段，当蛋白的丰度比即差异倍数达到1.5倍以上，且经统计检验其p-value值小于0.05时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。我们将iTRAQ鉴定出的所有蛋白和所有的差异蛋白进行生物信息学分析。
　　三、ELISA方法验证iTRAQ分析发现的差异蛋白质
　　每组各取6例孕鼠血清，加样、酶标抗体孵育、底物显色、终止反应、酶标仪OD值检测、根据标准曲线计算浓度，具体操作按试剂盒说明书严格执行，验证iTRAQ分析发现的差异蛋白质。并检测不同时间点(E11、13、15、17)孕鼠血清和羊水中LIFR、PCSK9浓度，同时在不同孕周NTDs及正常孕妇血清中检测PCSK9水平。
　　结果：
　　一、先天性脊柱裂大鼠模型
　　维甲酸140mg/kg给药成功制作先天性脊柱裂大鼠动物模型，共剖检孕鼠(E11、E12、E13、E15、E17)130只。维甲酸致畸孕鼠54只，共获得胎鼠285只，其中脊柱裂胎鼠175只，无畸形胎鼠110只（致畸率61.4％）;对照组孕鼠60只，共获得正常胎鼠200只。
　　二、iTRAQ分析结果
　　在本次质谱实验中共得到谱图157422张，通过Mascot软件进行分析后，匹配到的谱图数量是7303张，其中Unique谱图数量为6013张，共鉴定到390个蛋白，2167个肽段，其中含1880个Unique肽段。当蛋白丰度差异倍数达到1.5倍以上，且经统计检验其p-value值小于0.05时，视为差异蛋白，共发现E11天维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白40种，E13天维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白26种，E11天与E13天正常对照组差异蛋白48种，E11天与E13天维甲酸致畸组差异蛋白38种。
　　在差异蛋白中，维甲酸致畸组与正常对照组比较，蛋白APOM，PCSK9在E11天和E13天同时下调，蛋白FGG, Uncharacterized在E11天和E13天同时上调，蛋白PLA2g2a，FGI2，SERPINE2，TUBB5，FG11，HP在E11天下调而E13天上调。
　　结论：
　　1、筛选出致畸早期大量神经管畸形和正常孕鼠血清差异蛋白质，其分子功能以结合、催化、转运活性为主，大部分蛋白参与生物调节、细胞、代谢过程，COG注释差异蛋白主要参与蛋白质翻译后修饰、折叠、分子伴侣和细胞骨架功能，差异蛋白通过直接或间接地相互作用，促进或者抑制神经管畸形的发生与发展。
　　2、孕妇血清PCSK9水平神经管畸形组较正常组显著下调，ROC曲线分析，PCSK9成为候选神经管畸形孕妇血清学早期无创产前诊断分子标志物之一。
　　3、差异蛋白LIFR、PCSK9在胚胎发育不同阶段存在时空表达变化规律，提示其参与脊柱裂胎鼠神经损伤的发生。

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