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过表达整合素连接激酶通过NF-kB信号途径促进结直肠癌细胞侵袭及转移

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英文缩略语

论文一 过表达ILK基因结直肠癌稳定转染细胞株的建立

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 过表达ILK对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三 过表达ILK对结直肠癌细胞上皮间质转化的影响及机制

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 ILK与肿瘤侵袭转移的最新进展

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摘要

目的：
　　研究整合素连接激酶在结直肠癌细胞侵袭转移中的作用、可能涉及的信号通路及其作用机制。
　　材料与方法：
　　1、细胞培养和试剂
　　人结直肠癌细胞系SW480从中国科学院细胞中心（中国，上海）购买并保存于37℃、5％ CO2、饱和湿度环境下Leibovitz's L-15培养基(Gibco，Grand Island，NY, USA)，培养基含10％胎牛血清(FBS; HyClone，Logan，UT, USA)和抗体。细胞用胰蛋白酶处理，常规每2-3天传代一次。为了抑制NF-κB的活性，将10μmol/LBAY11-7082(Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen，China)加入培养基反应2天时间。
　　2、质粒构建和转染
　　人ILK基因的编码序列(NCBI Reference Sequence: NM004517.2)通过PCR扩增获得，并将之导入pcDNA3.1表达质粒之中。合适的序列以及定位通过直接的DNA序列来确定。转染前1日，按每孔2×105个细胞将SW480细胞接种于6孔板。细胞通过脂质体2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)用2μg ILK表达质粒转染或2μg对照质粒转染。转染48h后，细胞在选择性培养基(G418，800mg/mL)内培养3-4周。选取G418抗性克隆，通过RT-PCR和Western blot分析确认后进行扩增。
　　3、RNA干扰
　　NF-κB p65(5'-CCUCCUUUCAGGAGAUGAATT-3')的双链寡核苷酸小干扰RNA以及错义对照(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')由中国上海吉玛公司抗体(稀释1∶1000)、抗IκBα抗体(稀释1∶1000)、抗磷酸化IκBα抗体(稀释1∶1000)、抗vimentin抗体(稀释1∶1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA，USA)，抗E-cadherin抗体(稀释1∶500)、抗Snail抗体(稀释1∶500)、抗Slug抗体(稀释∶1000; Abcam，Cambridge，MA，USA)和抗β-actin抗体(稀释1∶5000，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)孵化，之后再用辣根过氧化物酶联二抗处理。利用增强的化学发光试剂盒(Millipore)可见特异性的蛋白条带。
　　7、免疫荧光检测
　　细胞生长于玻璃显微镜盖玻片上，用4％多聚甲醛固定并用0.1％tritonX-100透性化。之后，一抗E-cadherin用PBS按1∶100稀释，滴加至完全覆盖细胞，4℃过夜。滴加荧光二抗FITC标记山羊抗兔抗体。清除二抗，滴加DAPI至完全覆盖细胞。激光共聚焦显微镜观察染色效果(FV1000S-SIM/IX81;Olympus，Tokyo，Japan)。
　　8、划痕实验
　　SW480细胞加至6孔板中直至达到预定浓度。弃去培养基4小时，利用200μl移液管的尖端制造细胞划痕。之后，用无血清培养基清洗细胞表面去除细胞碎片，用新鲜培养基继续培养。划痕分别于0小时、6小时以及12小时拍照。计算细胞迁徙距离与原始划痕宽度的比值。
　　9、跨膜实验
　　使用预涂含有细胞外基质蛋白基质聚对苯二甲酸乙二醇酯膜(8μm pores; BDBio-sciences，San Jose，CA，USA)的Boyden小室进行细胞侵袭评价。将含有3×105个细胞的500μl无血清培养基加到小室的上部，将800μl的细胞培养基(10％ FBS)加到小室的底部作为化学引诱物。37℃孵育24小时，用棉签擦去微孔膜上层细胞，以多聚甲醛于室温下固定20 min，苏木素染液染色。在倒置相差显微镜下对迁移至微孔膜下层的细胞进行计数。每个样本随机选取6个视野计数细胞个数。
　　10、统计学分析
　　所有的数据均以均数±标准差的形式表示。统计学分析采用单因素方差分析以及Bonferroni事后检验。P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果：
　　1、pcDNA3.1-ILK质粒可成功转染SW480细胞系并表达。
　　2、过表达ILK可增强SW480细胞系的侵袭转移能力。
　　3、过表达ILK可诱导SW480细胞系发生上皮间质转化。
　　4、过表达ILK诱导SW480细胞系发生上皮间质转化的过程中有赖于NF-κB信号通路。
　　结论：
　　过表达ILK可诱导SW480细胞系发生上皮间质转化并增强其侵袭转移能力。在过表达ILK诱导SW480细胞系发生上皮间质转化的过程中，NF-κB信号通路涉及其中。

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