NOD样受体蛋白3在伴放线聚集杜菌对人成骨样细胞MG63细胞凋亡的诱导及作用机制探讨

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牙周病是牙周支持组织的慢性感染性疾病，是我国成年人失牙的最主要原因。菌斑细菌及其产物是引发牙周病致病的始动因子，在牙周疾病的发生和发展过程中起主要作用。伴放线聚集杆菌（Aggregatibacteractinomycetemcomitans，A.a）是已知的重要牙周病原菌之一，与侵袭性牙周炎及慢性牙周炎的发生有密切关系，其产生的多种毒力因子能够造成牙槽骨破坏，曾在多种人类牙周疾病中检测到它的抗原。研究表明伴放线聚集杆菌可以在体外诱导成骨细胞(osteoblast)凋亡，包括人成骨样细胞MG63和小鼠成骨样细胞MC3T3-E1等不同细胞株系。但目前，伴放线聚集杆菌诱导成骨细胞凋亡的具体分子机理还不十分清楚，有待于进一步深入研究。
　　NLRP3(NOD-likereceptorprotein3)炎症复合体，由NLRP3（也称NALP3）、ASC(Apoptosis-associatedspeck-like,caspaserecruitmentdomain-domaincontainingprotein)、Cardinal和Caspase-1前体组成，负责激活Caspase-1以及后续的将pro-IL-1β和pro-IL-18加工为成熟的IL-1β和IL-18。研究表明，NLRP3在沙门氏杆菌（Salmonellaenterica）诱导的成骨细胞凋亡中起重要作用，其机制可能与NLRP3抑制NF-κB的激活有关。沙门氏杆菌侵入成骨细胞会诱导NLRP3表达量增加。与未转染的成骨细胞相比，在siRNA介导的NLRP3表达量下调的成骨细胞中沙门氏杆菌侵入诱导的细胞凋亡受到明显抑制，表明NLRP3在沙门氏杆菌侵入诱导成骨细胞凋亡的过程中是必须的。伴放线聚集杆菌可以在体外诱导人单核白细胞(mononuclearleukocytes)中NLRP3表达量上调及NLRP6表达量下调，同时还会诱导IL-1β和IL-18等炎症因子的表达。但是，NLRP3炎症复合体在伴放线聚集杆菌诱导的人成骨样细胞MG63细胞凋亡过程中所发挥的作用尚未见报道。
　　本研究分为三部分，首先通过体外培养人成骨样细胞MG63及伴放线聚集杆菌ATCC29523菌株，以不同的感染复数感染细胞，模拟体内感染成骨细胞的真实情况。然后，明确伴放线聚集杆菌菌体诱导人成骨细胞凋亡的能力。最后，检测NLRP3炎症复合体各组成成分NLRP3、ASC、cleavedcaspase-1p10以及经它们的加工而产生的IL-1β、IL-18在不同感染复数伴放线聚集杆菌感染的MG63细胞中的表达情况。并且应用siRNA干扰下调表达的NLRP3，之后再观察伴放线聚集杆菌诱导MG63细胞凋亡的能力是否发生变化。最终明确NLRP3炎症复合体在人成骨样细胞MG63凋亡过程所发挥的作用，为抑制伴放线聚集杆菌诱导成骨细胞凋亡过程寻找新的靶点，为牙周疾病的防控及治疗提供理论依据。
　　一、伴放线聚集杆菌侵入人成骨样细胞(MG63)模型建立
　　目的：调整伴放线聚集杆菌及人成骨样细胞状态，为后续实验奠定基础。以不同感染复数伴放线聚集杆菌菌体侵入MG63细胞，明确菌体的侵入效率，确定RNA干扰NLRP3后所使用的菌体感染复数。
　　方法：培养人成骨样细胞MG63及伴放线聚集杆菌ATCC29523，以不同比例伴放线聚集杆菌菌体侵入人成骨样细胞MG63，实验分为对照组、低感染复数伴放线聚集杆菌侵入组、中感染复数伴放线聚集杆菌侵入组、高感染复数伴放线聚集杆菌侵入组。侵入前，先用荧光染料5-二醋酸羧基光素琥珀酸单胞菌酯(CFSE)标记伴放线聚集杆菌。侵入时根据各组的感染复数，将相应体积的A.a菌液加入到成骨细胞中孵育，使A.a侵入时间达到24h。流式检测含有荧光标记细菌的细胞所占百分率以及平均每个细胞的相对荧光强度，以明确各组伴放线聚集杆菌入侵细胞情况。
　　结果：成功的复苏、培养了伴放线聚集杆菌ATCC29523和人成骨样细胞MG63。流式细胞术检测结果显示，感染复数从500∶1到1000∶1时，伴放线聚集杆菌对细胞的侵入率明显上升，而从1000∶1到2500∶1时，侵入率不升反降。相对荧光强度结果显示在伴放线聚集杆菌与细胞的比例为500∶1和1000∶1时，相对荧光强度较高，之后比值增加相对荧光强度呈下降趋势。
　　结论：伴放线聚集杆菌菌体对人成骨样细胞MG63的侵入效率较高，其中采用中感染复数1000∶1时，伴放线聚集杆菌侵入MG63的效果最为理想。
　　二、伴放线聚集杆菌侵入成骨样细胞MG63后对细胞凋亡的影响
　　目的：以检测乳酸脱氢酶(LDH)活性、Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术三种方法检测不同比例伴放线聚集杆菌侵入成骨样细胞MG63诱导其凋亡的情况。
　　方法：按第一部分的方法采用伴放线聚集杆菌侵入MG63细胞（不用CFSE标记），实验分为Control组、MOI:500∶1组、MOI:1000∶1组、MOI:2500∶1组。侵入结束后，收集各组细胞上清液，试剂盒方法检测各组细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)活性;应用Hoechst33258染液对各组细胞进行染色，于荧光显微镜下观察细胞凋亡情况;应用AnnexinⅤ-FITC和PropidiumIodide对各组细胞染色后，上流式细胞仪进行凋亡检测。
　　结果：与对照组相比，侵入伴放线聚集杆菌的各组细胞所释放的LDH活性显著提高(P＜0.01)。并且随着感染剂量的增加，LDH的活性逐渐增强。感染复数从500∶1到1000∶1时，LDH量明显上升，而感染复数从1000∶1到2500∶1时，LDH上升趋势不明显。Hoechst染色结果显示侵入伴放线聚集杆菌的各组细胞细胞核浓染现象均增加。感染复数从500∶1到1000∶1时，表示凋亡特征的浓染现象明显增多，而感染复数从1000∶1到2500∶1时，这种浓染现象变化不明显。AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测结果显示与对照组相比，侵入伴放线聚集杆菌的各组细胞的早期凋亡率和总凋亡率均显著提高(P＜0.01)。且随着感染复数的增大，MG63的早期凋亡率和总凋亡率一直增加。当感染复数为2500∶1时，MG63早期凋亡率达到67.98％，总凋亡率高达78.14％。说明伴放线聚集杆菌能够明显地诱导人成骨样细胞MG63凋亡，并且侵入24h时，凋亡均以早期凋亡为主。
　　结论：试剂盒检测LDH活性、Hoechst染色及流式细胞术检测细胞凋亡结果均显示伴放线聚集杆菌的侵入能有效地诱导人成骨样细胞MG63的凋亡，并且在一定范围内随着侵入比例的增加，细胞凋亡的程度也随之增加。
　　三、NLRP3炎症复合体在伴放线聚集杆菌侵入成骨样细胞MG63并诱导其凋亡过程中的作用机制
　　目的：通过检测NLRP3炎症复合体各相关成分NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1p10以及经它们的加工产物IL-1β、IL-18在各组细胞中的表达情况，在siRNA干扰下调MG63中NLRP3后再检测伴放线聚集杆菌诱导细胞凋亡情况，明确NLRP3炎症复合体在人成骨样细胞MG63凋亡过程所发挥的作用。
　　方法：按第一部分的方法应用伴放线聚集杆菌侵入MG63细胞（不用CFSE标记），实验分为对照组、MOI:500∶1组、MOI:1000∶1组、MOI:2500∶1组。Westernblot方法检测各组细胞中NLRP3、ASC、cleavedcaspase-1p10的表达。Real-timePCR检测各组细胞中NLRP3mRNA的表达。ELISA方法检测各组细胞培养上清中IL-1β、IL-18的含量。应用siRNA干扰下调MG63细胞中的NLRP3，之后用MOI:1000∶1的伴放线聚集杆菌侵入各组细胞，实验分为Control+A.a组、NC+A.a组、NLRP3-siRNA+A.a组。Real-timePCR检测各组细胞中NLRP3的表达情况。AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。
　　结果：与对照组相比，侵入伴放线聚集杆菌的各组细胞中NLRP3、ASC、cleavedcaspase-1p10的表达显著提高（P＜0.01），上清中IL-1β、IL-18的含量也显著提高（P＜0.01）。与对照组相比，siRNA成功干扰NLRP3后，伴放线聚集杆菌诱导MG63细胞凋亡的能力显著下降（P＜0.01）。
　　结论：在伴放线聚集杆菌诱导人成骨样细胞凋亡的过程中，NLRP3炎症复合体的相关成分NLRP3、ASC、cleavedcaspase-1p10以及它们加工的下游产物IL-1β、IL-18的表达量均增加。干扰NLRP3后，伴放线聚集杆菌诱导人成骨样纽胞凋亡的能力明显受到阻碍。
　　NLRP3炎症复合体是伴放线聚集杆菌诱导人成骨样细胞凋亡的前提条件之一。

著录项

作者
赵磐玉;
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作者单位

中国医科大学;

展开▼
授予单位中国医科大学;
学科口腔临床医学
授予学位博士
导师姓名潘亚萍;
年度 2014
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类牙周病;
关键词
牙周病; NOD样受体蛋白3; 伴放线聚集杆菌; 成骨样细胞; 凋亡机制; 诱导作用;

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