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【6h】

吡啶甲酸铬对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及对高糖环境下3T3-L1脂肪细胞固醇调节元件结合蛋白-1表达的影响

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摘要

背景
　　 研究发现,补充三价铬(Cr3+)可降低糖尿病患者的血糖和血脂水平,但其确切的分子机制尚不清楚。铬(Chromium)是人体必需微量元素之一,有多种氧化态,其中Cr3+为人体所必需,其有机形式吡啶甲酸铬(Chromium picolinate,CrPic)可在体内发挥最大生物学效应。最近研究表明,3T3-L1脂肪细胞膜上胆固醇含量可影响葡萄糖转运,当CrPic作用于细胞时,细胞膜胆固醇含量下降,葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)激活,葡萄糖向细胞内转运增加,外源性胆固醇回填到细胞膜阻碍了CrPic对GLUT4的激活作用。
　　 固醇调节元件结合蛋白(sterol regulation element binding protein,SREBPs),对胆固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成有重要调控作用。当细胞需要胆固醇时,位于内质网/高尔基体不成熟形式的SREBP-1分裂,以成熟形式从内质网/高尔基体膜上释放,在细胞核中与固醇反应原件结合,调节控制胆固醇平衡蛋白的表达。
　　 目的
　　 本研究旨在进一步探讨Cr3+降低血糖的分子机制,讨论不同浓度CrPic对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响以及对高糖环境下3T3-L1脂肪细胞中SREBP-1表达的影响,探讨CrPic是否影响SREBP-1的表达,进而影响细胞膜的胆固醇水平,参与葡萄糖向细胞内的转运。
　　 方法
　　 用含10%胎牛血清的IMDM培养基培养3T3-L1前脂肪细胞,长满80%时传代,转种于96孔板(细胞密度为5×104个/ml),常规培养12h,换以用IMDM培养基配制的Crpic溶液(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1umol/L、10umol/L、100umol/L)分别培养,同时设空白对照组(培养液),连续培养16h,MTT法检测不同浓度Crpic对3T3-L1前脂肪细胞增殖活力的影响。将3T3-L1前脂肪细胞接种于24孔培养板(细胞密度为5×104个/ml),待细胞融合2d后用于实验。分组:1组:加入正常诱导剂Ⅰ;2组:加入不同浓度Crpic(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)的诱导剂Ⅰ,培养48h;换以用诱导剂Ⅱ配制的各组溶液,再培养48h,每2d换培养液一次,一共培养8-12d,用油红O染色法检测不同浓度Crpic溶液对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。3T3-L1脂肪细胞以每孔5×104个/ml铺板到6孔培养板,48h后采用传统鸡尾酒诱导剂将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟3T3-L1脂肪细胞,换上含0.2%BSA的IMDM无血清培养基培养12h,分组:对照组:5.0mmol/L葡萄糖加20mmol/L甘露醇,干预组1:5.0mmol/L葡萄糖加20mmol/L甘露醇加不同浓度Crpic(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L),干预组2:25.0mmol/L葡萄糖,干预组3:25.0mmol/L,葡萄糖加不同浓度Crpic(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L),培养16h后用免疫细胞化学法检测各实验组SREBP-1的表达。
　　 结果
　　 与对照组相比,各浓度实验组OD值相对于空白对照组均降低,其中10nmol/L、100nmol/L浓度实验组对3T3-L1前脂肪细胞增殖的抑制作用最明显,细胞增殖活性分别比对照组低11.56%、13.73%,具有显著差异(P＜0.01)。
　　 诱导分化前的3T3-L1前脂肪细胞呈典型的梭形,胞浆中无脂滴,形态与成纤维细胞相似。当细胞完全融合后,处于生长停滞,未见处于明显分裂相的细胞,诱导分化第4天时,细胞变大、变圆,细胞中有脂滴出现。诱导分化第12天时,前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,表现为细胞胞浆丰富,含有大量的脂滴,脂滴分布于核周围,形成“戒指环”结构,为典型的成熟脂肪细胞形态。经不同浓度Crpic干预后,各浓度实验组细胞与空白对照组相比分化不同程度被抑制,表现为细胞内脂滴形成减少,其中10nmol/L浓度实验组相对于空白对照组,细胞分化程度降低37.29%,100nmol/L组降低41.52%。相对于其他浓度实验组分化程度也显著降低,差异具有显著性(P＜0.01)。
　　 SREBP-1表达于3T3-L1脂肪细胞的胞质与脂肪滴内,DAB染色表现为棕黄色颗粒,胞核内无着色。干预组2相对于对照组SREBP-1表达均明显升高(P＜0.01)。干预组3中的各浓度组与干预组2相比,SREBP-1表达水平降低,其中10nmol/L和100nmol/L浓度的Crpic处理组降低的最明显,阳性区域积分光密度值分别为49251.04±835.75和49129.20±1042.33,比高塘组减少了42.57%和42.71%,差异均具有显著统计学差异(P＜0.01)。干预组1中的各浓度组较对照组SREBP-1的表达水平无明显差异(P＞0.05)。
　　 结论
　　 Crpic对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化均具有抑制作用,且某一浓度的抑制作用最大;高糖可促进3T3-L1脂肪细胞SREBP-1的表达;Crpic可抑制高糖环境下3T3-L1脂肪细胞SREBP-1的表达,且某一浓度时的抑制作用最大,Crpic对正常糖条件下培养的3T3-L1脂肪细胞SREBP-1的表达无明显影响。

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