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尼莫地平对n-甲基-n-亚硝基脲所致大鼠视网膜色素变性的作用及机制探讨

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摘要

视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa，RP)是一种具有代表性的遗传性，退行性视网膜变性疾病。即患者最终都会因视网膜感光细胞缺失而致视功能下降甚至完全丧失。患病率约0.03％[1]。目前主要治疗方法为药物治疗、视网膜色素上皮移植以及新近展开研究的基因治疗，但对RP的临床治疗效果仍不理想。
　　 N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)属于亚硝基化合物中的亚硝酸胺类，是广泛分布于环境中的强烷化剂。关于MNU对大鼠视网膜的毒理学研究表明:MNU腹腔注射后的大鼠感光细胞核上可见甲基化的DNA嵌合物形成(7-甲基脱氧尿苷DNA嵌合物)，细胞膜通透性改变，MNU对感光细胞DNA的烷化作用是其引起视网膜毒性的直接原因[2]。烷化剂对细胞DNA的损伤如果没有被修复，则细胞将发生凋亡[3]。1967年，Herrold首先发现叙利亚金黄地鼠在经腹腔注射MNU后发生视网膜退行性变性[4]。1996年，Nakajima等的研究证实MNU诱导的大鼠视网膜变性是由于感光细胞凋亡所致[5]。由于MNU诱导的感光细胞损害具有高度的可重复性，这种动物模型成为研究人类RP治疗措施的有用工具[6]。
　　 近年来，钙离子拮抗剂用于神经退行性疾病及视网膜变性的研究日益成为研究热点。例如，研究表明钙离子拮抗剂尼伐地平延迟小鼠视网膜变性的发生时间。尼莫地平(Nimodipine，NMD)是二氢吡啶类衍生物，属典型的钙通道阻滞剂，具有良好的脂溶性，易通过血脑屏障，能显著抑制细胞外钙离子内流，从而阻断“缺血瀑布”损伤的中心环节[7]。常用于心血管相关疾病，如心绞痛、心律失常、高血压等，研究发现尼莫地平对很多中枢神经系统疾病有重要作用，如脑缺血、脑损伤、中风、痴呆、癫痫、老年相关退行性疾病[8-11]。
　　 Aslan[12]等人报道认为尼莫地平对头部创伤具有保护作用。眼科学研究领域，最近的研究表明尼莫地平对缺血所致视网膜损伤有保护作用，对视网膜动脉有舒张作用[13-14]。报道显示尼莫地平能提高青光眼患者视野及改善血流动力学。临床实验表明尼莫地平能够改善视功能[15-17]，用于正常眼压的青光眼患者。此外，离体实验表明尼莫地平能够拮抗Aβ或谷氨酸引起的神经毒性作用，通过抑制玻璃体谷氨酸浓度的升高而起到视神经保护作用，细胞实验表明通过抑制Ca2+内流对低氧所致节细胞损伤具有保护作用[18-20]。
　　 以上结果提示尼莫地平对眼科疾病可能具有治疗意义，然而尼莫地平对于该研究领域研究很少，对于视网膜变性疾病的作用未见报道。为此，本研究通过腹腔注射MNU建立RP的大鼠模型，采用光、电镜技术及视网膜电生理实验检测尼莫地平对视网膜色素变性治疗的形态学改变和视功能的作用;采用流式细胞术和RT-PCR实验技术，检测尼莫地平对MNU诱发大鼠视网膜凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3的表达和对线粒体膜电位的影响;并采用生物化学手段检测尼莫地平对MNU所诱导大鼠RP视网膜GSH及TGF-β水平的影响，为尼莫地平应用于视网膜色素变性的治疗提供理论依据。
　　 材料与方法：
　　 一、动物来源及准备
　　 实验动物SD大鼠，雌性，共90只，体重为90-120克，系清洁级动物。动物随机分组，分3组，即生理盐水对照组(NC)、模型组(MNU)及尼莫地平组(NMD)。
　　 二、方法
　　 （一）尼莫地平对MNU所诱导大鼠视网膜色素变性的影响
　　 1.光镜下视网膜组织形态学观察
　　 2.透射电镜下视网膜组织形态学观察
　　 3.视功能检查，记录大鼠视网膜电图
　　 （二）尼莫地平对MNU所诱导RP大鼠的Bax、Bcl-2及Caspase-3表达和线粒体膜电位的影响
　　 1.流式细胞仪检测Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表达
　　 2.RT-PCR检测视网膜组织Caspase-3 mRNA的表达
　　 3.流式细胞仪检测视网膜细胞线粒体膜电位
　　 （三）尼莫地平对MNU所诱导大鼠RP的GSH及TGF-β的影响
　　 1.应用二硫代二硝基苯甲酸法检测视网膜GSH的含量
　　 2.采用ELISA法检测视网膜TGF-β的含量
　　 结果：
　　 （一）尼莫地平对MNU所诱导大鼠视网膜色素变性的影响
　　 1.尼莫地平对MNU所诱导大鼠RP光镜形态学改变
　　 NC组大鼠光感受器细胞大小均匀，疏密有度，排列有序;MNU组大鼠光感受器细胞遭到严重破坏，外核层变薄，细胞排列紊乱，细胞数目减少。尼莫地平组视网膜内的光感受细胞数较MNU组比较明显增厚，细胞数目增加，结构清晰，排列整齐。
　　 2.尼莫地平对MNU所诱导大鼠RP透射电镜形态学改变
　　 透射电镜下，NC组光感受器细胞的外节膜盘整齐，胞核异染质可见。MNU组可见外节部分膜盘叠状结构解离，膜间隙增大，可见空泡样改变;线粒体空泡变性，嵴模糊不清，相互融合;外核层部分胞核肿胀，部分染色质浓缩，结构模糊，重者核溶解。尼莫地平组仅见外节膜盘排列轻度紊乱，内节线粒体轻度肿胀，空泡化减少，界限较清晰，嵴清晰。
　　 3.视功能检查
　　 记录各组大鼠视网膜电图，NC组均可记录到典型的ERG波形。MNU组大鼠ERG呈熄灭型，a、b波振幅与NC组比较差异显著。尼莫地平组大鼠a、b波振幅与MNU组比较明显改善，有显著性差异。结果表明尼莫地平可拮抗MNU所诱导大鼠RP视功能的下降。
　　 （二）尼莫地平对MNU所诱导RP大鼠的Bax、Bcl-2及Caspase-3表达和线粒体膜电位的影响
　　 1.MNU组与NC组比较，Bax，Caspase-3表达增高，Bcl-2表达降低;尼莫地平组与MNU组比较Bax，Caspase-3表达降低，Bcl-2表达增高。
　　 2.MNU组与NC组比较，Caspase-3 mRNA表达增高，尼莫地平组与MNU组比较Caspase-3 mRNA表达降低。
　　 3.MNU组荧光强度均较NC组显著减弱，说明MNU可引起的细胞线粒体膜电位下降。尼莫地平组荧光强度较MNU组增强，膜电位水平增高。
　　 （三）尼莫地平对MNU所诱导大鼠RP的GSH及TGF-β的影响
　　 1.MNU模型组视网膜GSH含量均明显低于正常对照组(P＜0.01)，尼莫地平治疗组GSH含量明显高于模型组(P＜0.05)
　　 2.MNU模型组视网膜TGF-β含量均明显高于正常对照组(P＜0.01)，尼莫地平治疗组TGF-β含量明显低于模型组(P＜0.05)
　　 结论：
　　 1.尼莫地平对MNU诱导的大鼠视网膜光感受器细胞损伤具有拮抗作用。
　　 2.尼莫地平对MNU诱导的大鼠视功能降低具有拮抗作用。
　　 3.MNU腹腔注射后，大鼠视网膜Bcl-2表达水平下降，Caspase-3、Bax表达水平上升，尼莫地平通过提升大鼠视网膜Bcl-2表达水平，降低Caspase-3、Bax蛋白表达水平从而达到抑制光感受器细胞凋亡的作用。
　　 4.MNU腹腔注射后，大鼠视网膜Caspase-3 mRNA表达水平上升，尼莫地平能降低视网膜Caspase-3 mRNA的表达，从而抑制光感受器细胞的凋亡。
　　 5.尼莫地平拮抗MNU所致细胞凋亡的可能机制是通过提高细胞内线粒体膜电位水平。
　　 6.尼莫地平治疗，可明显增加MNU大鼠视网膜GSH的含量，从而减轻氧化应激对视网膜的损伤。
　　 7.尼莫地平抑制了MNU大鼠视网膜TGF-β的表达，从而减轻MNU大鼠视网膜损伤。

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