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水杨酸对大鼠下丘GABAA受体α1亚单位及大型GABA能神经元影响的实验研究

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摘要

前言：
　　 耳鸣是指在没有外界刺激的情况下耳中出现声音。大剂量水杨酸可引起人和动物一过性的耳鸣。水杨酸引发耳鸣的起源部位及其发生机制尚未明确。目前比较公认的机制是水杨酸引起一系列神经活动的改变,破坏了脑活动的兴奋抑制平衡,引起神经过度兴奋而造成耳鸣。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中一种主要的神经递质。电生理学研究证实在耳鸣相关的神经活动中存在γ-氨基丁酸介导的抑制活动减弱的现象,然而目前参与这一过程的分子机制和细胞特异性通路尚不明确。GABAA型受体(GABAA)是由多种亚单位构成的五聚体离子通道蛋白。该受体蛋白的功能主要取决于其亚单位的组成及五聚体的分子构象。已发现有八种不同的GABAA亚单位:α、β、γ、δ、θ、ε、π和ρ。在大鼠下丘最主要的GABAA亚单位是α1。目前已知α1亚单位与癫痫、慢性酒精中毒症状、酒精戒断症状、焦虑症等疾病的发生密切相关。在听觉系统,则与声创伤等疾病的发生有关。但α1亚单位的确切生理功能乃至是否参与耳鸣的发生尚不明确。下丘是上行性听觉传导通路必经的中继站。以往电生理、分子生物学等多方面研究结果均提示下丘是潜在的耳鸣起源部位。此外,多项研究结果显示在大鼠的下丘有多种GABA能神经元存在,但目前对它们各自的功能和纤维联系知之甚少。最近有报道推测胞膜外覆盖着囊泡谷氨酸转运体2(VGLUT2)+谷氨酸能轴体末端的大型GABA能神经元可能是顶盖丘脑辐射的起源。但目前尚未见该神经元与水杨酸耳毒性发生相关的研究报道。
　　 目的：
　　 本次研究的目的是通过对GABAA相关蛋白在水杨酸注射前后的整个下丘及在大型GABA能神经元中的分子生物学及形态学检测结果进行统计学对比分析,揭示大剂量水杨酸是否能够引发相关蛋白的表达及分布的显著变化,从而初步探讨导致水杨酸耳毒性发生的可能的分子机制及细胞特异性听觉传递通路。
　　 方法：
　　 46只成年雌性SPF级SD大鼠,14-15周龄,重250-350g,随机分为实验组和对照组。两组动物分别腹腔注射水杨酸和等量生理盐水,连续注射5天。各组动物于第六天用水合氯醛深度麻醉后,其中30只大鼠(10只实验组,10只对照组)的下丘于5min之内取出并立即于-80℃冻存以备进行免疫印迹及实时定量PCR检测。另外16只大鼠经心脏灌流固定后取脑以备电镜免疫细胞化学和免疫组化切片检测。
　　 1、总RNA提取,反转录,实时定量PCRGABAAα1、GABAAβ2亚单位(GABAAβ2)、GABAAγ2亚单位(GABAAγ2)、谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)在实验组和对照组大鼠下丘的mRNA表达水平用real-timeRT-PCR来检测。
　　 2、免疫组织化学GABAAα1在实验组和对照组大鼠下丘细胞水平的分布用免疫组织化学来检测。
　　 3、免疫沉淀和免疫印迹检测GABAAα1在实验组和对照组大鼠下丘的蛋白定量用免疫沉淀和免疫印迹方法来检测。
　　 4、电镜免疫细胞化学GABAAα1在大鼠下丘亚细胞水平的分布特点用DAB标记的电镜免疫细胞学来检测。并比较该蛋白在实验组和对照组大鼠下丘不同部位所占百分比的差异。
　　 5、激光共聚焦显微镜免疫组化GABAAα1、GAD67在实验组和对照组大鼠下丘大型GABA能神经元中的分布和蛋白表达水平以及与大型GABA能神经元形成突触的谷氨酸能轴体末端内VGLUT2蛋白表达用激光共聚焦显微镜检测。切片经GAD67,VGLUT2和GABAAαl三种荧光抗体标记。
　　 结果：
　　 1、实时定量PCR:实验组的GABAAα1,GAD67的mRNA表达水平明显低于对照组,即分别为对照组的0.43倍和0.40倍(P＜0.05,P＜0.01)。GABAAβ2,γ2和GAD65实验组mRNA水平分别为对照组的0.89倍,1.56倍和0.84倍,P＞0.05。即大剂量水杨酸能够降低大鼠下丘GABAAα1、GAD67的mRNA表达,而对GABAAβ2、GABAAγ2和GAD65的mRNA表达没有明显影响。
　　 2、免疫组化:可见α1亚单位在大鼠下丘表达丰富,尤其在中央核区,各组下丘的中央核区均可见较强的α1亚单位阳性染色。阳性染色主要分布在胞膜和胞质。此外,阳性染色在大小不同的多种细胞中均可见到。仅靠免疫组化染色不能区分这些细胞,但是显然在一类体型远大于其它的细胞中普遍出现很强的α1亚单位阳性染色,它们通常直径＞10μm,主要分布于中央核区。
　　 3、免疫沉淀和免疫印迹:水杨酸注射组GABAAα1蛋白水平明显降低(对照组,0.65±0.08,实验组0.38±0.1,P＜0.01)。结果提示水杨酸注射后GABAAα1蛋白在大鼠下丘的表达水平明显降低。
　　 4、电镜免疫细胞化学:GABAAα1在大鼠下丘亚细胞水平的分布用电镜免疫细胞化学术来检测。结果显示,GABAAα1阳性染色在实验组和对照组均呈现为密集的暗黑色DAB沉淀,或浓聚在突触部位(突触后膜或相对应的突触前膜)或覆盖于突触外胞内膜性器官上。大多数的阳性标记出现在对称性突触(抑制性)。兴奋性突触多无GABAAα1阳性标记。对两组中GABAAα1在突触和突触外分布的比较结果显示,对照组中GABAAα1阳性染色在突触部位占70.1±3.5%,而实验组突触部位的阳性染色仅占52.2±2.8%(P＜0.05),即GABAAα1阳性染色在对照组中央核区域突触部位所占比率明显较实验组高。
　　 5、激光共聚焦显微镜:GABAAα1和GAD67蛋白表达:扫描结果显示,GABAAα1和GAD67蛋白在LGNs中表达均很丰富。在LGNs中,GABAAα1和GAD67蛋白均分布在神经元胞质和胞膜以及突起上。对两组动物下丘LGN中GAD67和GABAAα1荧光强度的半定量统计分析结果显示,对照组GAD67和GABAAα1的平均荧光强度分别为102±8.0和87±6.2,而在实验组中分别为83±12.2和59±9.5。该结果提示,在每组所选的30个LGNs中,GAD67和GABAAα1的平均荧光强度在水杨酸注射后出现明显下降,P＜0.05。即水杨酸注射后GAD67和GABAAα1在LGNs上的蛋白表达明显减少。
　　 VGLUT2+谷氨酸能轴体末端:VGLUT2蛋白在激光共聚焦扫描中呈现出点状标记的模式。扫描结果显示VGLUT2+轴体末端位于LGNs的胞体和树突的表面。用ImageJ图像分析软件对扫描图像进行三维重建后显示,VGLUT2+轴体末端在LGNs胞膜表面呈现不均匀分布。对每个选定的LGNs中VGLUT2平均荧光强度测量结果显示,对照组中VGLUT2的平均荧光强度是123±11.5而在实验组中是120±9.6。统计结果提示水杨酸注射没有使轴体末端中的VGLUT2蛋白表达发生明显的变化,P＞0.05。
　　 讨论：
　　 1、GABAAα1和GAD67转录具有活动依赖性
　　 很多研究证实α1亚单位的mRNA表达是活动依赖性的,并且发现了一些可能存在的受复杂系统调控的机制。N-甲基-D-天冬氨酸,GABA和苯二氮卓都能在一定条件下改变α1亚单位的mRNA水平。有两种谷氨酸脱羧酶(GADs)催化GABA的合成:GAD67和GAD65(分别由Gad1和Gad2基因编码),它们的基因调控过程迥异。GAD67活动的生理调节的关键步骤就是Gad1的转录,该过程在发育过程中受到神经活动和发育经历的动态调节。因此,在本实验中,α1亚单位和GAD67在实验组下丘中的mRNA表达改变可能就是通过这些途径来实现的。
　　 2、GABAAα1基因和蛋白表达减少及亚细胞水平分布的改变可能影响GABAA的功能
　　 GABAA是含有氯离子通道的五聚体膜蛋白。目前已知α1亚单位参与形成GABAA中苯二氮卓结合位点及神经类固醇分子结合位点,并有可能介导苯二氮卓引起的共济失调、镇静和慢性酒精中毒综合征。电生理研究证实,α1亚单位能产生快速电流衰减并引起对唑吡坦的敏感性。因为α1是大鼠下丘GABAA中含量最丰富的亚单位,水杨酸注射后其基因和蛋白含量降低可能由于苯二氮卓及神经类固醇受体结合位点形成缺陷及快速电流衰减障碍而影响GABAA的功能。此外,在细胞的不同部位存在两种GABAA,即突触GABAA和突触外GABAA。亚单位组成的不同造成两者的药理学特性迥异。本实验中电镜免疫细胞化学结果显示GABAAα1参与形成突触和突触外两种GABAA的形成。以往耳聋相关研究结果显示GABAA能够在突触和胞质之间移动。本实验中就GABAAα1阳性染色在突触和突触外分布的分析结果提示部分GABAAα1可能在水杨酸注射后由突触上迁移到了突触外。而GABAA由突触部位离开是失去在突触部位原有功能的可靠信号。
　　 3、GABAAα1和GAD67表达水平可能影响LGNs的功能
　　 结果5显示,GABAAα1和GAD67在LGNs上表达均很丰富。由于α1亚单位在GABAA中具有重要功能,因此LGNs中α1亚单位的显著减少很可能由此而影响LGNs的功能。谷氨酸合成GABA的过程由GAD67催化,超过90%的基础GABA是由GAD67催化合成的。GABA的合成是GABA代谢中的限速步骤,很容易影响细胞及囊泡中的GABA含量。有研究显示,敲除GABA能中间神经元的GAD67可引起大脑皮质器官型培养的细胞在突触形成,轴突衍生和神经支配区域方面出现自发的严重缺陷。近来有研究显示LGNs可能是向内侧膝状体(MGB)投射的抑制性顶盖丘脑辐射的起源。然而,GABA能和谷氨酸能神经元均参与形成MGB投射。因此,LGNs中GAD67和GABAAα1表达减少可能会影响LGNs介导的下丘与MGB之间的抑制性投射,导致两者间原有的兴奋和抑制平衡被破坏。
　　 4、VGLUT2+轴体末端对水杨酸的反应相对稳定VGLUT2蛋白的功能是囊泡谷氨酸转运体,负责将谷氨酸转移到突触小泡中。在本实验中,标记VGLUT2的荧光强度代表参与形成轴体突触的谷氨酸在突触末端的含量。多个研究已证实大鼠下丘的LGNs通过轴体末端接受VGLUT2+谷氨酸能冲动传入,但这些末端的起源和功能并未弄清。有人提出有可能使LGNs发出的神经冲动更加迅速。本实验中,水杨酸注射后VGLUT2蛋白在轴体末端的表达没有明显变化。这或许提示了该轴体突触与水杨酸造成的神经过度兴奋并无密切联系。
　　 结论：
　　 大剂量水杨酸注射后GABAAα1在大鼠下丘的分布和基因蛋白表达发生了显著的变化,而且GABAAα1和GAD67蛋白在LGNs中的表达也较注射前显著降低。这些变化可能会影响自下丘到内侧膝状体的抑制性听觉投射,导致神经过度兴奋而造成对耳的毒性。

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