STK15通过IkB磷酸化调节CDK2基因表达与喉癌中心体扩增研究

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前言：喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一。在我国,东北地区是喉癌的高发地区。过去的10年中,我国喉癌的发病率呈现上升的趋势。喉癌对放疗及化疗均不敏感,手术是目前治疗的主要手段,但手术会给患者造成不同程度的损伤。目前,喉癌的发生机制尚不明确,探索喉癌发生机制,将有助于从根本上解决喉癌防治的关键问题,因此,发现喉癌发生相关基因、探索喉癌发生机制已经成为喉癌研究的热点问题。
　　染色体异常被认为是肿瘤细胞的特征性改变,而细胞有丝分裂异常常可以引起染色体不稳定。中心体作为细胞的主要微管组织中心,在细胞周期过程中建立两极纺锤体,调节细胞有丝分裂,对维持细胞的染色体稳定起着重要的作用。因此肿瘤细胞中的染色体异常可能与中心体的异常密切相关。现己发现了许多肿瘤细胞中存在多种中心体异常,而中心体扩增是常见异常之一。STK15、CDK2基因是与中心体密切相关的基因,STK15、CDK2基因的异常表达可以引起中心体扩增,导致染色体不稳定,从而引起细胞恶性转化。
　　前期研究发现STK15在喉癌组织中存在mRNA高表达,并检测到喉癌组织原代培养细胞中心体扩增,近期有报道指出STK15能够通过IkB磷酸化激活NF-kB,另有报道指出在喉癌组织中NF-kB信号通路被激活,在前期工作中我们利用软件预测到CDK2启动子区存在4个NF-kB潜在结合位点,提示STK15可能通过NF-kB途径调控CDK2表达,进而促进中心体扩增。本研究中,我们利用RT-PCR和Western blot方法检测STK15、CDK2基因在喉癌组织中的表达,利用表达载体和干扰载体上调或下调STK15基因表达,检测其对CDK2基因表达的影响。利用NF-kB抑制剂和过表达质粒改变NF-kB信号通路,检测NF-kB对CDK2表达和中心体的影响。根据以上结果,我们进一步通过荧光素酶报告基因分析、凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP),深入探讨STK15通过NF-kB调节CDK2表达和中心体扩增的机制,为从中心体扩增角度研究喉癌的发生奠定基础。
　　材料与方法：
　　一、实验材料
　　 1.喉癌肿瘤及癌旁对照组织,人喉癌细胞系Hep-2,人胚肾细胞系HEK293。
　　 2.RT-PCR及Western blot实验相关试剂。
　　 3.免疫荧光相关试剂。
　　 4.重组质粒构建相关试剂。
　　 5.萤光素酶报告基因检测相关试剂。
　　 6.电泳泳动迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂。
　　二、实验方法
　　 1.以临床喉癌标本和喉癌Hep-2细胞系、人胚肾细胞HEK293细胞系为实验材料,应用RT-PCR和Western blot检测喉癌组织和细胞中STK15、CDK2基因的表达情况。
　　 2.以HEK293细胞为对照,应用免疫荧光方法检测Hep-2细胞中中心体扩增。
　　 3.应用STK15表达载体和针对STK15基因的shRNA干扰载体改变STK15表达水平,检测其对IkB磷酸化和CDK2表达的影响。
　　 4.利用IkB磷酸化抑制剂BAY11-7082抑制NF-kB通路,利用NF-KB表达载体增强NF-kB表达,研究NF-kB对CDK2表达和中心体扩增的影响。
　　 5.应用软件分析CDK2启动子结构;并构建系列截短的CDK2启动子荧光素酶报告基因质粒,应用双荧光素酶检测系统分析各段启动子的活性。
　　 6.EMSA方法体外鉴定CDK2启动子区NF-kB反应元件;ChIP实验进一步在体内条件下检测NF-kB与该位点的结合作用。
　　结果：
　　 1.RT-PCR和Western blot结果显示,人喉癌组织中STK15、CDK2 mRNA和蛋白表达水平均高于癌旁对照组织。
　　 2.喉癌Hep-2细胞中发现了明显的中心体扩增,发生中心体扩增的细胞数占细胞总数7～12％,明显高于HEK293细胞。
　　 3.STK15过表达能够促进IkB磷酸化,增强CDK2基因表达。靶向STK15的RNA干扰作用能够降低IkB磷酸化水平,降低CDK2表达。
　　 4.IkB磷酸化抑制剂BAY11-7082能够降低CDK2表达,抑制喉癌细胞中心体扩增。外源NF-kB能够促进HEK293细胞CDK2表达,促进中心体扩增。
　　 5.荧光素酶报告基因分析结果显示位于CDK2启动子区-1010至-1001的潜在NF-kB结合元件对于NF-kB诱导的CDK2转录激活有重要意义。
　　 6.EMSA实验在体外条件下证明了CDK2启动子-1010至-1001区为NF-kB反应元件;ChIP实验进一步在体内条件下获得了相同的结果。
　　结论：
　　 1.与癌旁正常组织相比较STK15、CDK2基因在喉癌组织中高表达,揭示其可能参与喉癌中心体扩增和喉癌发生发展。
　　 2.喉癌细胞中中心体扩增显著,可能是喉癌发生的原因之一。
　　 3.STK15通过IkB磷酸化增强CDK2基因表达,从而促进中心体扩增和喉癌发生。
　　 4.CDK2启动子区-1010至-1001为NF-kB结合元件,对于调节CDK2表达具有重要作用。

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作者
刘剑利;
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作者单位

中国医科大学;

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授予单位中国医科大学;
学科遗传学
授予学位博士
导师姓名李福才;
年度 2011
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类喉肿瘤;肿瘤病因学、发生学;
关键词
喉癌; STK15; CDK2基因表达; 中心体扩增; NF-kB磷酸化; 喉鳞状上皮细胞癌; 发生机制;

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