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先天性脊柱裂和先天性肛门闭锁胎鼠产前标记物筛查和发病机制研究

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摘要

研究目的：
　　 先天性脊柱裂和先天行肛门闭锁是儿童常见的畸形,在中国的发病率较西方国家高,发病率分别为1‰-5‰和0.2‰-0.7‰。外科手术后,仍有大约1/3儿童出现不同程度的尿、便失禁,严重影响患儿生理和心理发育。由于这些畸形的发病机制并不清楚,病理改变复杂,目前尚无良好的预防和治疗措施。口服叶酸可以降低50-70％的发病率,但目前仍然没有完全预防和治愈的方法;虽然70-80％的神经管畸形可能通过产前筛查手段如超声及孕妇血清AFP筛查出来,但目前并没有脊柱裂和锁肛的特异性产前诊断标记物。目前关于这些畸形的发病机制,基于基因研究方法相关研究很多,但迄今为止,还没有一个基因被证实是导致这些畸形的直接原因。因此,研究这些畸形的胚胎发生机制和遗传基因调控规律,对于寻找胚胎早期治疗和预防的新措施具有极其重要意义。
　　 蛋白质是基因的表达产物,直接参与细胞内外生理代谢途径,而基于基因表达水平的研究并不能提供基因和及其蛋白质丰度之间的关系。蛋白质组学能够同时提供大量的蛋白质变化信息,是一种比较全面了解机体病理病理状态下蛋白质变化的手段。羊水常常被用来进行产前检查及诊断,包含了大量的蛋白质,这些蛋白质主要源自:羊膜上皮细胞、胎儿组织、胎儿排泄物和胎盘组织,此外,孕妇血液循环中的一些物质也能进入羊水中。羊水组成变化随怀孕周期不断变化,羊水蛋白谱变化能够反应孕妇和胎儿的生理和病理变化。通过2-d电泳-质谱检测羊水蛋白谱变化是一种发现疾病相关标记物的有效方法。维甲酸是维生素A的一种代谢产物,是正常胚胎发育必须物质。但是怀孕动物服用过量的维甲酸会导致各种畸形的发生。目前常利用孕鼠服用全反式维甲酸可以用来制作脊柱裂和肛门闭锁胎鼠模型。研究发现,孕17.5-19.5期间,胎鼠脊髓长度较正常胎鼠变短,而脊髓发育异常是脊柱裂和肛门闭锁的主要临床表现之一,因此我们采用2-d/质谱电泳方法,比较17天正常组胎鼠和维甲酸诱导的脊柱裂和肛门闭锁胎鼠的羊水蛋白和脊髓蛋白表达谱变化,筛查先天性脊柱裂和先天性肛门闭锁相关羊水标记物,筛查先天性脊柱裂和先天性肛门直肠畸形脊髓发育相关蛋白质。
　　 材料与方法
　　 1、脊柱裂和锁肛动物模型建立
　　 (1)将孕鼠随机分为:致畸组24只和正常对照组9只。孕10日晨,参考文献[10]方法,将维甲酸混悬液(按40mg/ml混匀于橄榄油)按每千克体重135 mg/kg通过胃管灌饲。对照组(9只)给予同样体积的橄榄油。
　　 (2)孕17天晨,采用过量的水合氯醛腹腔注射麻醉孕鼠,显微镜下获取每个胎囊的羊水及胎鼠,并检查胎鼠畸形情况(脊柱裂、肛门闭锁),并记录死胎吸收胎和活胎的数目。
　　 (3)分别提取脊柱裂、肛门闭锁和正常对照组的羊水、脊髓组织(全段)。新鲜的羊水标本置于离心机中离心15分钟,10000 rpm,4℃,以去羊水中除不可溶的杂质,相同畸形的羊水组织分装,-80℃储存;相同的脊髓组织每3根分装,-80℃储存。
　　 2、羊水蛋白质组和脊髓蛋白组双向电泳(每份样品重复3次)
　　 (1)双向电泳样品准备
　　 每组(脊柱裂、肛门闭锁和正常对照组)各取5ml羊水加入Amicon Ultra-4超滤膜过滤装置(Millipore),置于离心机中离心1小时浓缩羊水,转速3800rpm,4℃。然后加入Protein A/G column(Merck)中去除高丰度白蛋白和IgG,滤过液再次通过Amicon Ultra-4超滤膜过滤装置(Millipore)浓缩。然后采用Bradford assay方法测量蛋白浓度。
　　 将脊髓按10％(W/V)比例加入裂解液中,裂解液配方如下(7 M Urea,2Mthiourea,4％(V/W)CHAPS,2％(V/V)IPG buffer(pH4-7),40 mM1,4-dithioerythritol,1mM PMSF and1％(V/V)cocktail protease inhibitor,Sigma),然后用超声的方法匀浆1分钟,整个过程置于冰屑中,以防止蛋白质降解。然后参照2D-Clean Up kit(GE,Healthcare)手册,提取脊髓蛋白,Bradford方法检测蛋白浓度后进行分装,-80℃保存或进行下一步实验。
　　 (2)双向电泳
　　 步骤1.等点聚焦(Ettan IPGphor System,GE Healthcare)
　　 ①羊水蛋白等点聚焦:去除高丰度白蛋白和IgG的浓缩羊水蛋白800μg和10μl蛋白酶抑制剂预混,加入上样液中(8M urea,2％CHAPS,2％IPG buffer(pH4-7linear),0.2％DTT(DTT临用前加入),终体积450μl。加入上样槽中,置入IPG胶条(24cm,pH4-7,GE Healthcare,Uppsala,Sweden),加入覆盖油。将胶槽置入EttanIPGphor System(GE Healtheare)仪器中。IPG再水化,30 V,12 h。然后300 V,3小时,逐步上升至600 V,1350 Vhrs,逐步上升至1000V,2400Vhrs,逐步上升至8000 V,13500 Vhrs.8000 V聚焦67000 Whrs。
　　 ②脊髓蛋白等点聚焦:800μg和10μl蛋白酶抑制剂预混,加入上样液中(8Murea,2％CHAPS,2％IPG buffer(pn4-7 linear),0.2％DTT(DTT临用前加入),终体积450μl。加入上样槽中,置入IPG胶条(24cm,pH4-7,GE Healthcare,Uppsala,Sweden),加入覆盖油。将胶槽置入Ettan IP Gphor System(GE Healthcare)仪器中。IPG再水化,30 V,12 h。300 V,3小时,逐步上升至600 V,1350 Vhrs,逐步上升至1000V,2400Vhrs,逐步上升至8000 V,13500 Vhrs,8000 V聚焦7000Vhrs.
　　 步骤2.平衡及垂直电泳(ETTAN Twelve apparatus,GE healthcare)
　　 取下IPG strips置入10ml平衡液1(6 M urea,30％glycerol,2％sodium dodecylsulfate(SDS),115 mM Tris-Cl pH8.8,20mM dithiothreitol(DTT))和平衡液2(6 Murea,30％ glycerol,2％ sodium dodecyl sulfate(SDS),115 mM Tris-Cl pH8.8,100mM iodoacetamide)各10分钟。
　　 采用12.5％聚丙烯酰胺胶(260 mm×20 mm×1.5 mm)在ETTAN Twelveapparatus(GE healthcare)中进行SDS-PAGE电泳,1w/胶17小时,15℃。
　　 步骤3.胶体染色及图像扫描
　　 结束后按照Candiano et al进行Coomassie Brilliant Blue G-250染胶。每组样本包含3块胶,因此本实验中共计9块胶。染色液配方如下:0.12％考马斯亮蓝G250,10％硫酸铵,10％磷酸,及20％甲醇。配置过程如下:加入最终容量10％的MilliQ水,加入磷酸,硫酸铵(粉末状),搅拌使硫酸铵粉末混合均匀溶解后,加入考马斯亮蓝G-250,搅拌溶解后,加MilliQ水至终容量的80％,加入20％终容量的甲醇,使甲醇浓度保持在20％,搅拌均匀后密封保存。使用PowerLook2100XL图像扫描仪(Umax,Taiwan)采集图像。
　　 步骤4.2-d图像分析及质谱检测
　　 采用2D分析软件(ImageMaster2D platinum6.0,GE,Healthcare)进行选点、定量和匹配工作。蛋白点通过自动检测方法产生,手动编辑蛋白点如分开两个点或删除假点。采用t-test比较每个点的相对体积(％vol),。相对体积相差1.5倍(P＜0.05)定义为差异表达蛋白点,选取送做质谱分析。
　　 3、质谱鉴定
　　 (1)液相色谱-质谱串联仪器分析方法:胶内酶解是参照A.Shevchenko提出的优化方法操作并进行了一些微小的修改。具体过程如下:需要鉴定的双向蛋白点被切成大约1 mm3左右的胶粒并转移至1.5 ml Axygen EP管中。在EP管中加入100μl脱色液(100 mM碳酸氢铵与纯乙腈按照1:1的体积比混合)置于涡旋混合器上振荡大约30分钟直至大部分蓝色脱去(此步操作将根据具体脱色程度进行重复)。弃去脱色液,在EP管中加入500μl纯乙腈并在室温振荡进行脱水直至胶粒皱缩变白。待乙腈挥发后,在EP管中加入适量20 mM DTT置于56℃水浴中还原30分钟,冷却至室温后加入55 mM碘乙酰胺避光进行烷基化反应20分钟。反应完毕后加入纯乙腈再次对胶粒进行脱水,并加入适量的TPCK修饰过的胰蛋白酶(大约50μl.将胰蛋白酶溶于含有10％乙腈的10 mM碳酸氢铵溶液中配制成终浓度为13 ng/μl的工作液)覆盖脱水后的胶粒使胰酶溶液充分吸入胶粒。根据情况可以适量补充胰酶工作液以免胶粒变干。将EP管置于37℃的恒温振荡器上孵育过夜。酶解后的胶粒通过100μl的肽段提取液(5％的甲酸与纯乙腈按照1:2的体积比进行混合)进行抽提。抽提液置于旋转干燥仪SpeedVac上浓缩至大约30μl。浓缩后的肽段抽提液通过C18-HPLC偶联的装有自动进样器、微量电喷雾离子化源及离子阱质量分析器的液质联用质谱仪LCQ Deca XP(Thermo ElectronCorp.,San Jose,CA)进行分析。通过Xcalibur软件包中的EX-TRACTMS程序自动进行“峰值列表(peak list)”的生成,并且只有总离子流强度高于104的MS/MS图谱被用于搜索NCBI的蛋白fasta数据库(2009.3.23版本,同时含有180种最常见的污染物,包括角蛋白及蛋白酶等),检索软件为Bioworks软件包中的TurboSEQUEST算法(版本3.3)。设定的具体检索参数为:i)母离子碎片质量误差为1.4 amu;ii)子离子碎片质量误差为0.8 amu;iii)允许最多2个不完全酶切位点;iv)设定固定修饰为半胱氨酸巯基羧甲基化修饰(增加质量57.02 amu),设定可变修饰为蛋氨酸氧化修饰(增加质量15.99 amu)及丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化修饰(增加质量为79.97 amu)。通过对检索结果进行筛选,符合下列要求的肽段被认为是正确鉴定的蛋白:i)+1价,+2价及+3价肽段的Xcorr系数分别高于2.0,2.5,3.0;ii)最佳匹配肽段的△相关系数必须大于0.1;iii)Sp值必须高于600。正确鉴定的蛋白需要包含至少两个不同的肽段,单一肽段的蛋白(Single-hitprotein)通过TPP(Trans-Proteomics Pipeline,ISB美国系统生物学研究所)程序进行验证以减少假阴性结果。所有鉴定到蛋白的二级质谱的b,y离子系列都通过手动进行验证。
　　 (2)MALDI TOF/TOF质谱分析仪分析方法:胶点在脱色液中取色(60％CAN,25 mM NH4HCO3),置旋转风干仪SpeedVac中风干,然后放入胰蛋白酶(15ug/ml)再水化1小时,4℃,然后加入5 mL25 mM的NH4HCO3胶粒使胰酶溶液充分吸入胶粒,在37℃孵育16h。酶解后的胶粒通过肽段提取液(5％TFA,and2.5％TFA/50％CAN)进行抽提,37℃,1h。酶解的肽段在MALDI matrix(5 mg/mlα-cyana-4-hydroxycirmamic acid in0.1％TFA and50％CAN)中溶解,点样至192孔不锈钢MALDI target plates,然后使用ABI4800 MALDI-TOF/TOF质谱分析仪(Applied Biosystems,USA)分析。使用GPS ExplorerTM Version3.0软件和MASCOT数据库查询运算软件(version2.0),在the International Protein Index(IPI)Ratdatabase version数据库中查询MS和MS/MS结果。设定的具体检索参数为:胰蛋白酶特异性,半胱氨酸巯基羧甲基化修饰和蛋氨酸氧化修饰,1允许最多1个不完全酶切位点,MS允许0.2Da误差,MS/MS允许0.3 Da误差。符合下列要求的肽段被认为是正确鉴定的蛋白:MASCOT评分≥58和P值＜0.05。
　　 4、Western Blot
　　 每组相同含量的羊水蛋白或每组相同含量的脊髓蛋白,采12.5％SDS-PAGE胶进行电泳,采用trans-blot转印仪(Bio-Rad),将蛋白转印至PVDF膜(Millipore,USA),转印液配方(20 mM Tris-HCI,150 mM glycine,20％methanol)。然后加入相抗体,通过ECL reagents(GE,healthcare)检测抗原抗体复合物。采Quantity Oneimage processing software(Bio-Rad)进行条带分析。
　　 5、统计学分析
　　 每组实验至少重复3次。数据采用均值4-标准差(-x±s)表示。采用t-test统计学分析方法,P＜0.05被认为表达有显著差异。
　　 结果
　　 1、动物实验结果
　　 本研究共计获取120只脊柱裂胎鼠,100只锁肛胎鼠和100只正常胎鼠的脊髓及其羊水。
　　 2、羊水蛋白2-D电泳结果
　　 共获得62个差异表达的蛋白点,其中53个质谱分析得出结果,71.7％(37/53)的蛋白表达水平在先天脊柱裂、先天肛门闭锁和J下常胎鼠羊水中的变化趋势相似(按照脊柱裂、锁肛、正常组由小到大或由大到小排列)。鉴定出7种蛋白质(其中一种蛋白质可能对应多个蛋白点),包括:AFP,transferrin,srprb55kDa,srprb77kD,neurotrophin-5,alpha-1 antiproteinase及Apo A4。其中Apo A4,Srprb77 kDa和NT-5在畸形组表达下调,而transferrin,Srprb55 kDa和alpha-1 antiproteinase在畸形组表达上调。46个蛋白质点被鉴定为AFP及其片段,其中2个点为全长AFP,其它44个为AFP片段。
　　 3、脊髓蛋白2-D电泳结果
　　 脊髓组2-d电泳发现在先天脊柱裂和先天肛门闭锁组表达上调的蛋白质有4种,共5个点(一种蛋白质可能对应多个蛋白点),分别为:Serum albumin precursor,Catenin alpha1,CRMP-2,60S acidic ribosomal protein PO。表达下调的蛋白质有4种,共4个蛋白点,分别为:14-3-3 protein beta/alpha,Calponin-3,Hsc70,Hnrpkprotein。
　　 4、Western Blot结果
　　 在羊水蛋白中,通过western-bot共发现69 kDa、52 kDa、36 kDa、24 kDa和12 kDa五种分子量AFP片段。AFP在脊柱裂组上调42％(p＜0.01),锁肛组上调14％(P＜0.05),差异具有统计学意义,AFP在锁肛和脊柱裂组中表达差异不明显(P＞0.05)。Apo A4在脊柱裂组下调44％(P＜0.01),在锁肛组下调29％(P＜0.05),差异具有统计学意义,Apo A4在锁肛和脊柱裂组中表达差异不明显(P＞0.05),与2D结果一致。通过对质谱肽段分析,发现畸形组羊水表达上调的AFP蛋白质点80.56％(29/36)肽段集中在C-端(340-596),而正常组羊水中表达上调的AFP蛋白质点80％(8/10)肽段集中在N-terminus(25-440)。
　　 在脊髓蛋白中,通过western-blot分析,发现CRMP-2在脊柱裂组上调100％(P＜0.01),在锁肛组上调43％(P＜0.05);Hsc70在脊柱裂组下调55％(P＜0.01),在锁肛组下调30％(P＜0.05),与2-d结果趋势基本一致。
　　 结论
　　 1、采用Protein A/G columns(Merck)去除白蛋白和IgG及采用Amicon Ultra-4超滤膜过滤装置(Millipore)浓缩羊水蛋白的方法,可以去除高丰度蛋白,提高低丰度蛋白含量,是研究羊水蛋白组的有效方法。
　　 2、AFP、transferrin、srprb、neurotrophin-5、alpha-1 antiproteinase和Apo A4在先天性脊柱裂和锁肛胎鼠的羊水中表达异常,可以作为两种畸形羊水诊断的潜在标志物。
　　 3、Serum albumin precursor、Catenin alpha1、CRMP-2、60S acidic ribosomalprotein P0、14-3-3 protein beta/alpha、Calponin-3、Hsc70和Hnrpk protein在先天性脊柱裂和锁肛胎鼠的脊髓组织中表达异常,可能参与两种畸形发生和发展过程。

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