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缝隙连接及连接蛋白43在胰岛素调节大鼠血管平滑肌细胞收缩反应性中的变化机制及药物干预研究

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摘要

英文缩略语

论文一 缝隙连接及连接蛋白43及S368位点磷酸化在胰岛素调节大鼠血管平滑肌细胞收缩反应性中的变化

前言

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文二 胰岛素影响大鼠血管平滑肌细胞中缝隙连接通讯及Cx43表达变化的机制

前言

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文三 阿托伐他汀钙及通心络醇提物对高胰岛素培养的大鼠血管平滑肌细胞缝隙连接及Cx43影响

前言

实验方法

实验结果

讨论

小结

本研究的创新性自我评价

参考文献

综述 缝隙连接及连接蛋白与血管性疾病

在学期间科研成绩

致谢

个人简介

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摘要

研究背景:
　　冠状动脉痉挛是急性冠脉综合症、变异型心绞痛、冠状动脉微血管性心绞痛以及危及生命心律失常等多种心血管疾病的重要病因，并且急性心梗病人中激发性冠状动脉痉挛的发生是其预后不良的预测因子[1]。即使在现今因钙拮抗剂广泛使用并且可能引起冠状动脉痉挛的发生率逐渐降低的西方国家，对于急性胸痛的相对年轻患者仍应高度警惕痉挛性心绞痛的发生[2]。2008年公布的CASPAR试验结果表明超过四分之一的冠脉痉挛患者没有明显的冠脉血管阻塞，其中约百分之五十的患者存在明确的冠状动脉痉挛[3]。从Egashira[4][5]等发现在冠状动脉痉挛部位并未发现NO的减少，从而推测存在其他机制如磷脂酶C活性增高引起血管平滑肌细胞的高反应性而诱发变异型心绞痛的发生，人们对冠状动脉痉挛的机制研究逐渐从内皮功能不全转移到血管平滑肌细胞高反应性及其他[6]。
　　血管平滑肌细胞是调整血管张力的最终效应器官，血管平滑肌反应性大小与自身细胞间传递及依赖内皮调节有关。但血管壁平滑肌细胞间如何协同反应仍未完全明确。缝隙连接(gap junction，GJ)是存在于相邻细胞间的一种膜通道结构，作为一种直接通讯参与了细胞间的物质和信息的交流，存在于内皮细胞间、内皮和血管平滑肌细胞间以及血管平滑肌细胞间，对维持血管张力有重要作用。GJ的基本组成单位是是连接蛋白(Connexin，Cx)。在血管平滑肌系统以表达Cx43、Cx40、Cx37、Cx45为主，尤其在大的弹性动脉中层以表达Cx43为主，而在肌性动脉则以Cx40、Cx37、Cx45为主[7][8]。当机体受到高血压、动脉粥样硬化、缺血缺氧等所致细胞损伤或增生后，通过改变连接蛋白的表达，可以明显改变缝隙连接的功能，对血管壁的细胞间交流进行精细调节从而影响血管的舒缩功能，使机体对不同刺激做出及时、有效地应答，因此可能参与血管痉挛性疾病的发生[9][10]。Cx43似乎是机械变化的早期感受器，平滑肌细胞通过Cx43对增加的跨膜压作出相应的弹性和收缩性改变。研究表明Cx43的磷酸化与去磷酸化对缝隙连接通道功能有非常重要的影响。
　　胰岛素抵抗作为代谢综合症的中心环节，贯穿糖尿病发生发展的整个过程，在此过程中先出现高胰岛素血症等炎症性、氧化应激性改变之后逐渐出现高血压、高血糖等相关性疾病(11)(12)。有研究表明胰岛素抵抗伴有高胰岛素血症是冠状动脉痉挛的独立危险因素[13]。冠状动脉痉挛的发生与内皮功能不全、血管平滑肌反应性增高、氧化应激、离子失衡等有关。而IR作为一种致炎状态，与内皮功能损害、血管反应性、氧化应激等同样密切相关。但有研究表明胰岛素可以缓解冠状动脉痉挛并增加血流而改善血管痉挛患者的心绞痛症状。而高胰岛素水平又能促使内皮细胞产生ET-1而加重血管痉挛。不同浓度的胰岛素对弹力血管的舒缩功能改变产生的作用不同，而且在胰岛素抵抗状态下不同部位的血管反应性也发生不同变化[14][15]。究竟是什么原因导致这种病理生理差异性的改变，目前尚未知晓。研究显示氧化磷脂OxPAPC能够改变血管内皮细胞、平滑肌细胞中Cx37、Cx43的表达，与其增加Cx43T265位点磷酸化有关，并降低肌内皮缝隙连接功能，推测可能与高血脂、高血压及代谢综合征等引起的血管功能改变有关[16]。而RhoA-ROCK通路作为血管收缩的一个分子开关其激活与高血压、糖尿病及衰老状态下活性氧介导的血管平滑肌收缩功能改变有关[17]。目前氧化应激是否通过RhoA-ROCK通路对胰岛素抵抗状态下血管平滑肌细胞中缝隙连接蛋白的表达及缝隙连接间通讯交流产生影响的相关报道较少。
　　本课题组先期研究显示通心络通过多种途径可以抑制冠状动脉痉挛。其作用机制可能为抑制PKC活性，减少氧化应激的产生，促进NO的产生，减少抗氧化物质的消耗，抑制ET-1所致的病理状态;抑制Rho激酶表达、活性的增加从而持续有效的抑制血管痉挛的作用[18]）。通心络能否影响胰岛素抵抗引起血管损伤时的异常缝隙连接蛋白表达从而改变细胞间通讯交流未见报道。同时阿托伐他汀钙能够降低血管平滑肌细胞中Cx43的表达而抑制细胞增殖，但对慢性高浓度胰岛素培养下VSMCs中Cx43及磷酸化的影响尚未见报道，其中具体机制仍需进一步探求。
　　本课题分别应用不同浓度胰岛素、高糖与高胰岛素与大鼠主动脉平滑肌细胞共培养，并应用高浓度胰岛素予急性刺激，运用蛋白印记技术和共聚焦显微镜，分析缝隙连接及连接蛋白的表达变化并观察血管平滑肌细胞对5-HT的收缩反应性;观察平滑肌细胞内H2O2对缝隙连接及连接蛋白的影响及可能作用通路;研究他汀类药物及通心络醇提物改变缝隙连接及连接蛋白表达的可能机制，旨在阐明胰岛素对缝隙连接及连接蛋白参与血管平滑肌细胞收缩反应性的机制，开创防治冠脉痉挛药物作用新靶点，具有重要的理论和临床意义。
　　研究方法:
　　1、模拟不同胰岛素环境培养血管平滑肌细胞观察缝隙连接及连接蛋白43并磷酸化位点S368的变化。培养原代血管平滑肌细胞，取3-5代细胞分别在正常葡萄糖组、生理浓度胰岛素组、高浓度胰岛素组、高浓度胰岛素+高葡萄糖组培养24小时，之后予急性高浓度胰岛素刺激30分钟。采用共聚焦荧光显微镜观察5-HT作用下血管平滑肌细胞形态、钙浓度变化，荧光漂白恢复试验测定缝隙连接功能，western blot测定Cx43及Cx43-S368蛋白表达。
　　2、高胰岛素环境培养血管平滑肌细胞分析活性氧簇清除剂catalase、ROCK阻断剂Y-27632对缝隙连接及连接蛋白的影响，并探讨其中的关联。培养原代血管平滑肌细胞，取3-5代细胞分别在予catalase、Y-27632及二者共预处理后再分别与高浓度胰岛素共培养30min或24小时。采用共聚焦荧光显微镜观察5-HT作用下荧光漂白恢复试验测定缝隙连接功能，western blot测定Cx43及P-Cx43-S368蛋白表达。化学发光法及G-lisa法测定H2O2水平和RhoA活性变化。
　　3、慢性高胰岛素培养血管平滑肌细胞，分析阿托伐他汀钙、通心络醇提物对缝隙连接及Cx43及P-Cx43-S368的影响，同时测定H2O2、 RhoA活性变化，探讨阿托伐他汀钙及通心络的可能作用机制。
　　研究结果:
　　1、不同胰岛素环境与血管平滑肌细胞共培养24小时:①1nm/l、l00nm/l胰岛素及100nm/l胰岛素+25mmol/l葡萄糖处理细胞，激光共聚焦显微镜下观察VSMCs在5-羟色胺作用下收缩情况:A:细胞形态面积:生理浓度胰岛素组细胞缩小变化百分率（5.72±0.14）、急性胰岛素作用VSMCs面积缩小率(5.59±0.89)小于高胰岛素组（13.89±0.98）及高胰岛素+高糖组（14.78±1.02），P＜0.05，有统计学意义。B:Ca2+内流:生理胰岛素组钙荧光强度增加受抑制，而高胰岛素组及高胰岛素+高糖组增加，P＜0.05有统计学意义;急性高浓度胰岛素作用VSMCs，钙荧光强度增加但低于慢性胰岛素作用组，P＜0.05有统计学意义;②激光共聚焦显微镜下测定FRAP:在高胰岛素作用下最大荧光恢复比例、荧光恢复速率低于对照组和生理胰岛素组，P＜0.05，有统计学差异;在5-HT作用下，对照组、生理胰岛素组、急性高胰岛素组GJIC增加不显著或降低，而高胰岛素组及高胰岛素+高糖组明显增加，有统计学差异;③western检测Cx43及P-Cx43-S368蛋白表达:在胰岛素作用下各组均有P-Cx43-S368表达，随着浓度增加及时间延长而增加;急性胰岛素作用VSMCs，Cx43表达降低，而随着作用时间逐渐延长至24小时，Cx43表达增加;慢性胰岛素孵育VSMCs后再予急性胰岛素刺激，P-Cx43-S368表达继续增加，而Cx43增加不显著，与慢性组比较，前者有统计学意义，后者无统计学差异。
　　2、高胰岛素与VSMCs长时间共培养前经catalase(2000u/ml)、Y-27632(10umol/l)预处理30min后:①FRAP检测受抑制的GJIC恢复，与处理组比较有统计学差异;在5-HT作用下，GJIC增加不显著，较control组无统计学差异;western检测Cx43及P-Cx43-S368蛋白表达均明显降低，与胰岛素处理组比较有统计学差异;②G-lisa检测高胰岛素处理细胞24h后，细胞RhoA活性增高，较control组有统计学差异;预处理后RhoA活性下降，与处理组比较有统计学差异;③H2O2检测试剂盒检测100nmol/l insulin处理细胞24h后H2O2水平，与control组比较，H2O2增加有统计学意义(108.1±8.9 VS18.6±4.2，P＜0.01);预处理后H2O2水平下降，较处理组比较有统计学意义。高胰岛素与VSMC短时间共培养前经catalase(2000u/ml)、Y-27632(10umol/l)预处理后:①FRAP检测受抑制的GJIC恢复，与处理组比较有统计学差异;在5-HT作用下，GJIC抑制不显著，较control组无统计学差异;western检测P-Cx43-S368表达明显降低，与处理组比较有统计学差异;而Cx43表达恢复较comtrol组无差异;②G-lisa检测高胰岛素处理细胞30min后，细胞RhoA活性降低，较control组有统计学差异;catalase预处理后RhoA活性较control组无统计学差异;③H2O2检测试剂盒检测100nmol/l inslin处理细胞30min后H2O2水平，与control比较，H2O2增加有统计学意义(48.1±7.4VS18.4±3.2，P＜0.01)，预处理后H2O2水平降低，与对照组比较无统计学差异。
　　3、高胰岛素与VSMC长时间共培养前经atrovastatin(10umol/l)、通心络醇提物(5mg/ml)预处理20min后:①FRAP检测抑制的GJIC恢复，与胰岛素处理组比较有统计学差异;western检测Cx43及P-Cx43-S368蛋白表达均明显降低，与处理组比较，有统计学差异;②G-lisa检测细胞RhoA活性降低，较胰岛素处理组有统计学差异;③H2O2检测试剂盒检测H2O2水平，与胰岛素处理组比较，H2O2降低有统计学意义(atrovastatin组50.5±4.8VS108.1±8.9，P＜0.01;TXL组58.1±10.2VS108.1±8.9，P＜0.01);atrovastatin组与GGPP共孵育后atrovastatin作用均被逆转。
　　结论:
　　1、高浓度胰岛素影响大鼠血管平滑肌细胞缝隙连接通讯对5-羟色胺反应性和缝隙连接蛋白43表达，其变化呈双相特征，即高浓度胰岛素短时间处理细胞，GJIC反应性及Cx43下调，长时间处理细胞则反之;
　　2、胰岛素可引起缝隙连接蛋白S368位点磷酸化。
　　3、高浓度胰岛素通过H2O2调节血管平滑肌细胞RhoA活性，其调节具有双相特征;即高浓度胰岛素短时间处理细胞下调RhoA活性，长时间处理细胞则反之;并影响缝隙连接通讯对5-羟色胺反应性和缝隙连接蛋白43表达;
　　4、阿托伐他汀钙通过异戊二烯途径抑制慢性高浓度胰岛素诱导的血管平滑肌细胞Cx43及P-Cx43-S368高表达，恢复异常GJIC，是其心血管保护作用的多效性又一体现;通心络醇提物具有同样作用，可能与其抗氧化、抑制RhoA活性有关;
　　5、生理浓度胰岛素及急性高浓度胰岛素抑制血管平滑肌细胞GJIC对5-HT高反应性，是其生物学效应，是氧化应激的保护作用;而慢性高浓度胰岛素增强血管平滑肌细胞GJIC对5-HT高反应性是氧化应激的损伤性作用。

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